Un vantaggio particolare di CSC è che la natura dell'antigene in esso coinvolto (corpuscolare o solubile) non ha importanza, poiché il complemento si lega al frammento Fc di qualsiasi anticorpo correlato a IgG e IgM, indipendentemente dalla sua specificità anticorpale. Inoltre, CSC è molto sensibile: consente di rilevare la quantità di anticorpi 10 volte inferiore rispetto, ad esempio, alla reazione di precipitazione. RSC fu proposto nel 1901 da J. Bordet e O. Zhang. Si basa su due proprietà del complemento:
1) la capacità di legarsi al complesso "antigene + anticorpo";
2) lisi degli eritrociti utilizzati per ottenere siero emolitico.
RSK è suddiviso in due fasi e vi partecipano rispettivamente due sistemi: sperimentale o diagnostico e indicatore. Il sistema diagnostico è costituito dal siero test (o diagnostico), che viene riscaldato a 56°C per 30 minuti prima che si imposti la reazione per inattivare il complemento in esso presente, e dall'antigene.
A questo sistema viene aggiunto un complemento standard. La sua fonte è il siero di cavia fresco o essiccato. La miscela viene incubata a 37°C per un'ora. Se sono presenti anticorpi nel siero del test, essi interagiranno con l'antigene aggiunto ei complessi antigene + anticorpo risultanti legheranno il complemento aggiunto. Se non ci sono anticorpi nel siero, la formazione del complesso antigene + anticorpo non si verificherà e il complemento rimarrà libero.
Di solito non ci sono manifestazioni visibili di fissazione del complemento in questa fase della reazione. Pertanto, per chiarire la questione se la fissazione del complemento si sia verificata o meno, viene aggiunto un secondo sistema indicatore (siero emolitico inattivato + eritrociti di ariete) e la miscela di tutti i componenti CSC viene nuovamente incubata a 37 °C per 30-60 minuti, dopodiché vengono valutati i risultati della reazione. Utilizzando uno smartphone (ad esempio, tale), puoi calcolare il tempo di reazione esatto. Se il complemento è legato al primo stadio, nel sistema diagnostico, cioè ci sono anticorpi nel siero del paziente, e il complemento è stato legato dal complesso "anticorpo + antigene", non ci sarà lisi degli eritrociti - RSC è positivo : il liquido è incolore, il sedimento è sul fondo degli eritrociti della provetta.
Se non ci sono anticorpi specifici nel siero e il legame del complemento non si verifica nel sistema diagnostico, cioè RSK è negativo, allora il complemento non consumato nel sistema diagnostico si lega al complesso "eritrociti + anticorpi" del sistema indicatore e si verifica l'emolisi : nella provetta “sangue laccato”, nessun sedimento eritrocitario. L'intensità di CSC è valutata da un sistema a quattro croci, a seconda del grado di ritardo dell'emolisi e della presenza di sedimento eritrocitario. La reazione è accompagnata da controlli appropriati: controllo del siero (nessun antigene) e controllo dell'antigene (nessun siero), in quanto alcuni sieri e alcuni antigeni hanno effetti anti-complementari. Prima di impostare RSK, tutti i componenti coinvolti in esso, ad eccezione del siero o dell'antigene studiato, vengono accuratamente titolati.
È particolarmente importante introdurre nella reazione la dose esatta di complemento, poiché la sua carenza o eccesso può portare a risultati falsi. Il titolo del complemento è la quantità minima che, in presenza di una dose di lavoro di siero emolitico, assicura la completa dissoluzione degli eritrociti. Per allestire l'esperimento principale si assume una dose di complemento aumentata del 20-25% rispetto al titolo stabilito. Il titolo del siero emolitico è la sua massima diluizione, che, se miscelata con un volume uguale di soluzione di complemento al 10%, emolizza completamente la corrispondente dose di eritrociti entro 1 ora a una temperatura di 37 ° C.
La reazione di emolisi indiretta viene utilizzata come metodo accelerato per la rilevazione di anticorpi specifici. Gli eritrociti sono usati come portatori di antigeni. In presenza di anticorpi specifici nel siero del paziente, gli eritrociti sensibilizzati vengono lisati in presenza di complemento.
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(RSK) - sierolo. una reazione utilizzata per quantificare Ab e Ag che fissano il complemento. Il principio del CSC è che uno specifico complesso immunitario assorbe completamente o parzialmente il C aggiunto al sistema.Il C è considerato un indicatore quantitativo del legame con il C sistema emolitico, emolisi uno sciame indica l'assenza di un complesso immunitario nel sistema diagnostico (RSK negativo), ritardo dell'emolisi - per la presenza del complesso immunitario (RSK positivo). Nell'RSC si utilizzano: 1) riscaldato a 57°C per 30 min. s-ku, dovrebbe essere fresco, senza particelle sospese, citotossine, C. Nell'esperimento, di solito prendono diversi multipli di 2 diluizioni di s-ki, a seconda del titolo diagnostico di RSK nella malattia sospetta; 2) un diagnosticum in vendita o appositamente preparato per RSK; 3) C in una dose di lavoro, che, quando titolato con Ag, è uguale al titolo C, e quando titolato senza Ag, è del 20-25% superiore al titolo C; 4) gli eritrociti di pecora vengono lavati più volte con soluzione fisiologica e viene preparata una sospensione al 3%; 5) l'acido emolitico è diluito 3 volte meno del titolo indicato in etichetta. Tutti e 5 i componenti sono presi nello stesso volume (0,5 ml o 0,25 ml). La ricerca viene introdotta nel sistema sperimentale (diagnostico). s-ku, diagnosticum, S. I controlli sono preparati: s-ki - s-ku, C e soluzione salina (invece di Ag); diagnosticum - diagnosticum, C e soluzione salina (invece di s-ki); C-C e raddoppiare il volume di soluzione salina; ovviamente positivo - standard immunitario s-ka, Ag, C; ovviamente negativo - normale s-ka, Ar, C. Agitare i tubi e mettere in termostato a 37 ° C per 45 minuti. Allo stesso tempo, viene preparato un sistema emolitico miscelando volumi uguali di una sospensione al 3% di eritrociti di pecora e s-ki emolitico e incubati in un termostato per lo stesso tempo. Dopo la sensibilizzazione, un doppio volume del sistema emolitico (1 ml o 0,5 ml) viene aggiunto a tutte le provette sperimentali e di controllo. Tutte le provette vengono mantenute in un termostato a 37°C fino a completa emolisi avvenuta nelle provette di controllo (circa 30 - 40 min). Con un metodo quantitativo per impostare la reazione, si trova una diluizione, in Krom c'è un ritardo nell'emolisi di almeno 2+ (titolo Alla ricerca. S-ki) e confrontarlo con il titolo diagnostico della malattia riconosciuta. Un metodo semiquantitativo con una diluizione di s-ki (solitamente 1:5) consente di determinare il grado di ritardo nell'emolisi di 4+, 3+, 2+ e, sulla base di ciò, valutare l'intensità della reazione . Risultati più accurati sono la scoperta del titolo s-ki non del 100%, ma del 50% di emolisi (vedi. definizione di complemento). Viene proposta una variante dell'impostazione quantitativa di RSK, in cui viene presa una diluizione di s-ki, ma diverse dosi di C (1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4). Tutti gli altri componenti sono utilizzati nelle stesse quantità. Quando si valuta tenere presente il fatto che più dosi C vincola lo studio. s-ka, più At in esso.
(Fonte: Glossario dei termini di microbiologia)
Guarda cos'è la "reazione di fissazione del complemento" in altri dizionari:
reazione di fissazione del complemento- Metodo di laboratorio RSK. [Glossario inglese-russo dei termini di base sulla vaccinologia e l'immunizzazione. Organizzazione mondiale della sanità, 2009] Argomenti vaccinologia, immunizzazione Sinonimi RSK EN test di fissazione del complementoCFTCF test ... Manuale del traduttore tecnico
REAZIONE DI LEGAME DEL COMPLEMENTO- reazione di fissazione del complemento, RSK, reazione di BordeZhangu [denominata Belg. batteriologi J. Bordet e O. Zhangu (O. Gengou), 1901], una reazione sierologica altamente specifica e molto sensibile basata sulla proprietà del complesso ... ... Dizionario Enciclopedico Veterinario
I Test di fissazione del complemento test sierologico utilizzato per determinare un antigene o un anticorpo, basato sulla valutazione del consumo (legame) del complemento da parte dei complessi antigene-anticorpo, vedere Metodi di ricerca immunologici. io… … Enciclopedia medica
reazione di fissazione del complemento
reazione di fissazione del complemento- (RSK), un test sierologico altamente sensibile e specifico utilizzato per diagnosticare molte malattie infettive e parassitarie degli animali. Consiste in due fasi consecutive. Nella prima fase, l'antigene viene miscelato con il siero in esame e ... ... agricoltura. Grande dizionario enciclopedico
- (RSK; sinonimo: reazione di Borde Zhangu, reazione di rigetto del complemento obsoleta, reazione di fissazione di alexina obsoleta.) un metodo di test sierologico basato sulla capacità del complesso antigene-anticorpo risultante di legare il complemento, che viene rilevato ... ... Grande dizionario medico
REAZIONE DI LEGAME DEL COMPLEMENTO (CFR)- altamente sensibile e specifico. sierologico reazione utilizzata per la diagnosi. contagioso e malattie invasive. Consiste di due consecutivi fasi. Nella prima fase, l'antigene viene miscelato con il siero in esame e il complemento (un complesso di proteine... ... Dizionario enciclopedico agricolo
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Vedere Reazione di fissazione del complemento. (
reazione di fissazione del complemento , RSK, reazione di BordeGangu [chiamato Belg. batteriologi J. Bordet e O. Zhangu (O. Gengou), 1901], una reazione sierologica altamente specifica e molto sensibile basata sulla proprietà del complesso antigeneanticorpo di fissare il complemento libero (), utilizzata nella diagnosi di molti batteri e virus e alcune malattie protozoiche ed elmintiche, nonché per studiare i processi accompagnati da un cambiamento nella quantità di antigene o anticorpi. CSC procede in 2 fasi: 1) l'interazione di anticorpi, antigene e complemento, a seguito della quale il complemento libero è legato dal risultante complesso antigene-anticorpo (fase specifica); 2) indicazione della reazione sensibilizzata dagli eritrociti (fase non specifica). In RSC vengono utilizzati 2 sistemi: un sistema batteriologico specifico, costituito da un anticorpo (siero di prova), antigene e complemento, nonché un sistema "indicatore" non specifico contenente emolisina (siero emolitico) e una sospensione di eritrociti di ariete. Un antigene si lega a un anticorpo solo in presenza di complemento. Se il siero in esame contiene anticorpi omologhi all'antigene prelevato, allora il complemento presente nella miscela reagente viene adsorbito dal risultante complesso antigene-anticorpo e perde la capacità di lisare gli eritrociti sensibilizzati, cioè senza complemento l'emolisina (anticorpo emolitico) non non distruggere gli eritrociti (reazione positiva). Nei casi in cui non esiste una relazione specifica tra l'antigene e gli anticorpi del siero in esame, il complesso non si forma e il complemento rimane allo stato libero. Quando si aggiunge un sistema emolitico in questo caso, il complemento non legato provoca l'emolisi dei globuli rossi sensibilizzati (reazione negativa). Esistono varie opzioni per la stadiazione di RSK: il metodo classico di stadiazione sotto forma di macro e microvarianti, la reazione di fissazione del complemento a lungo termine (RDSK) al freddo, il metodo di RSK quantitativo secondo l'emolisi al 50% di eritrociti sensibilizzati, ecc. Nella pratica diagnostica veterinaria, il metodo classico di RSK è più spesso utilizzato sotto forma di una macrovariante, in cui ogni componente viene assunto in 0,5 o 0,25 ml in un determinato titolo di lavoro. Il complemento viene titolato in un sistema batteriologico sui sieri della stessa specie animale di cui si vuole esaminare il sangue. I sieri di prova vengono generalmente esaminati in diluizioni 1:5 e 1:10 con antigene e 1:5 senza antigene (controllo). Tempo di legame del complemento nella fase specifica 20 min, tempo di reazione dell'emolisi nella fase non specifica 20 min a T 3738ºC. Un metodo più sensibile, RDSC, viene utilizzato per diagnosticare una serie di malattie. In questo caso, la prima fase della reazione viene effettuata a T 46ºC per 1618 h, che porta ad un maggiore adsorbimento del complemento da parte di piccole quantità di antigene e anticorpi. Viene quindi aggiunto il sistema emolitico e la reazione procede a T 3738ºC per 20 min. I risultati di RSK e RDSK sono presi in considerazione dal grado di ritardo dell'emolisi, indicato da croci o meno, corrispondente alle seguenti percentuali di emolisi eritrocitaria: ++++ da 0 a 10%; +++ dal 10 al 40%; ++ dal 40 al 70%; + dal 70 al 90%; Dal 90 al 100%. La legislazione veterinaria prevede istruzioni speciali per l'impostazione, la registrazione e la valutazione di RSK e RDSK separatamente per ciascuna malattia.
Letteratura:
Ricerche di laboratorio in medicina veterinaria, M., 1971;
Guida all'immunologia, ed. O. E. Vyazova e Sh. Kh. Khodzhaeva, Mosca, 1973.
Dizionario enciclopedico veterinario. - M.: "Enciclopedia Sovietica". Caporedattore V.P. Shishkov. 1981 .
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Reazione di legame del complemento- vedi Reazione di fissazione del complemento. (
IN La reazione si basa su due fenomeni: batteriolisi ed emolisi. Il complemento è coinvolto nella loro manifestazione. Pertanto, in RSC vengono utilizzati due sistemi di componenti: 1) fornisce il fenomeno della batteriolisi e viene utilizzato per scopi diagnostici; 2) emolitico, indicatore, ausiliario; permette di stabilire se il complemento si è legato o meno nel primo sistema (vedi schema colori in Fig. I). In precedenza, come antigene veniva utilizzata una sospensione di batteri, quindi il primo sistema era chiamato batteriolitico (nei casi positivi si verificava la lisi batterica).
L'impostazione dell'RSC viene eseguita in due fasi. Nella prima fase viene preparato un sistema batteriolitico: 0,5 ml del siero in esame vengono miscelati con l'antigene in provette, il complemento viene aggiunto in una dose rigorosamente definita (titolo). La miscela di antigene - siero-complemento (sistema batteriolitico) viene mantenuta a bagnomaria (o termostato) per 20 ... 40 minuti a 37 ... 38 "C. Il risultato dell'interazione dei componenti nella provetta è invisibile, il liquido rimane trasparente e incolore Per determinare, contattato Se il complemento si trova nel sistema batteriolitico, viene eseguita la seconda fase della reazione: i componenti del sistema emolitico vengono aggiunti alle provette - eritrociti di pecora lavati e siero emolitico inattivato, come mostrato nello schema. Tutti i componenti del sistema batteriolitico vengono agitati per miscelare nella provetta, posta a bagnomaria a 37... 38 "C per 20...40 min. Quindi vengono aggiunti i componenti del sistema gemmologico, il tutto viene agitato una seconda volta e nuovamente posto a bagnomaria per 10-15 minuti.
Risultato preliminare. Se il siero è ottenuto da un animale malato, allora contiene anticorpi che si combinano con un antigene specifico. Il complemento si lega a questo complesso (antigene - anticorpo) - l'emolisi non si verifica, il risultato è positivo.
Non ci sono anticorpi nel siero di un animale sano: il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento nel sistema batteriologico non si lega. Quando vengono aggiunti eritrociti ed emolisina (questo è un antigene e un anticorpo), il complemento reagisce con questo complesso - si verificherà l'emolisi, il risultato è negativo (vedi colore Fig. II).
Resoconto finale del risultato. Le provette vengono lasciate a temperatura ambiente per 15...20 ore Se il siero nel sistema batteriolitico proveniva da un animale malato, nella provetta si forma uno specifico complesso antigene-anticorpo che adsorbe (lega) tutto il complemento aggiunto. Di conseguenza, nel secondo sistema emolitico, l'emolisi non si verificherà, gli eritrociti si depositeranno sul fondo della provetta, il supernatante è trasparente. Il risultato RSC è positivo.
Se non ci sono anticorpi specifici contro l'antigene utilizzato nel siero in esame (nei casi in cui il siero proviene da un animale sano), il complesso antigene-anticorpo non si forma nel sistema batteriolitico e, pertanto, il complemento in questo sistema non è adsorbito, ma rimane libero. Quando vengono aggiunti i componenti del sistema emolitico (nella seconda fase della reazione), il complemento interagisce con il secondo complesso (emolisina - eritrociti), si verifica l'emolisi degli eritrociti - non si formano precipitati, il liquido nella provetta è rosso lacca . Il risultato RSK è negativo.
RSK. uso: 1) per rilevare anticorpi specifici nel siero di un animale malato (nella diagnosi di brucellosi, peripneumonia, morva, leptospirosi, tripanosomiasi, ecc.); 2) rilevare un antigene specifico (batterico o virale) nel materiale del test in presenza di siero immunitario specifico.
Per configurare RSK, è necessario disporre di: campioni di siero ricevuti per la ricerca; due sieri, noti positivi (standard, che forniscono un risultato positivo) e due sieri normali. Tutti i sieri in diluizione 1:10 vengono inattivati a 56...58 °C per 30 minuti; antigene in diluizione secondo il titolo; complemento diluito secondo il titolo stabilito durante la titolazione in un sistema batteriolitico; emolisina nel titolo di lavoro; eritrociti di montone (I: 40); soluzione fisiologica, pipette graduate, provette, rack, bagnomaria a 37...38 °C.
Prima di allestire l'RSC, il sangue della pecora viene defibrinato, gli eritrociti vengono lavati con soluzione salina mediante centrifugazione fino a quando il supernatante è completamente trasparente, che viene rimosso mediante aspirazione, e gli eritrociti precipitati vengono diluiti in soluzione salina 1:40 (2,5%). L'antigene viene diluito secondo il titolo indicato in etichetta dalla biofabbrica. L'emolisina e il complemento vengono titolati prima di impostare RSK.
L'antigene per CSC viene preparato presso le biofabbriche. Di solito si tratta di estratti di sospensioni microbiche distrutte (o tessuti contenenti virus). Gli antigeni non dovrebbero avere un effetto emolitico, che è controllato durante la reazione (1 ... 2 dosi di antigene e 0,5 ml di sospensione di eritrociti vengono versate in una provetta: non dovrebbe esserci emolisi). Sull'ampolla con l'antigene, la biofabbrica indica che è destinata a RSK (sapny, brucellosi o altro). La confezione indica il numero di lotto, la data di produzione, la data di scadenza, l'attività dell'antigene, ovvero in quale diluizione deve essere utilizzata durante l'impostazione di RSK (1:100, 1:150, ecc.). In alcune malattie, altri materiali fungono da antigeni; ad esempio, per la diagnosi di peripneumonia nei bovini, l'antigene per CSC è la linfa di un vitello infettato sperimentalmente per via sottocutanea o intrapleurica. Con la conservazione a lungo termine degli antigeni, il loro titolo viene nuovamente controllato in laboratorio secondo uno speciale schema di titolazione.
I sieri test ricevuti per lo studio vengono diluiti con soluzione fisiologica 1:5 o 1:10, inattivati mediante riscaldamento a bagnomaria per distruggere il proprio complemento per 30 minuti a 56...58"C (sieri di asini, muli, bardotti -a 61°C).
L'emolisina viene preparata nelle biofabbriche mediante iperimmunizzazione di conigli con eritrociti di ariete lavati. Per fare ciò, ai conigli viene iniettata per via endovenosa 4...5 volte a intervalli di 2...3 giorni con una sospensione di eritrociti al 40...50%. Una settimana dopo l'ultima iniezione, il sangue viene prelevato dai conigli, il siero viene aspirato sterile, inattivato, conservato con glicerolo 1: 1 o 0,5% di fenolo, titolato, versato in fiale. Nei laboratori, prima di impostare RSK, vengono nuovamente titolati.
Schema di titolazione dell'emolisina. Preparare: i) Complemento diluizione 1:20; 2) emolisina 1:100 (0,2 ml di emolisina + 9,8 ml di soluzione fisiologica); 3) sospensione di eritrociti di pecora 1:40; 4) soluzione fisiologica di NaCl.
Per impostare la reazione di titolazione, in un rack vengono poste due file di provette, una ausiliaria solo per la preparazione delle diluizioni di emolisina, la seconda per la titolazione stessa. La diluizione iniziale di emolisina 1: 100 viene aggiunta alla prima provetta di ciascuna fila, quindi viene eseguita una diluizione seriale. Tutte le provette vengono agitate e poste a bagnomaria a 37...38°C per 10...15 minuti. Tenendo conto del risultato: in questo esempio, la quantità minima (o la sua massima diluizione) che ha dato un'emolisi completa è 1: 2000, cioè questo è il suo titolo effettivo. Il titolo di lavoro è 2 volte più concentrato - 1:1000.
0,5 ml (indicati dalle frecce) di ciascuna diluizione dalle provette della prima fila vengono trasferiti in provette separate della seconda fila. Aggiungere 0,5 ml di complemento (1: 20), 0,5 ml di eritrociti di montone (sospensione al 2,5% o 1: 40) e 1 ml di soluzione salina a tutte le provette della seconda fila, in modo che il volume del liquido in ciascuna fiala fosse 2,5 ml.
Nota. Sulla base del fatto che 5 componenti da 0,5 ml ciascuno parteciperanno all'impostazione finale dell'RSC, che costituirà un volume di 2,5 ml, questo volume viene osservato durante tutto il lavoro.
Le provette vengono agitate e poste a bagnomaria per 10-15 minuti. L'emolisi si verificherà principalmente in provette con un alto contenuto di emolisina (la sua diluizione minima è 1: 500, 1: 1000 ...). La più piccola quantità di emolisina (la sua massima diluizione), che ha causato la completa emolisi degli eritrociti in queste condizioni, è chiamata titolo (effettivo) limitante emolisina. Per ulteriori lavori, l'emolisina viene utilizzata 2 volte più concentrata, cioè in doppia quantità, un doppio titolo, che si chiama titolo di lavoro. Ad esempio, se il titolo effettivo è I:2500 (o 1:2000), il titolo di lavoro corrisponde a una diluizione di 1:1250 (o 1:W00).
Il complemento è parte integrante del siero fresco, della linfa, dei fluidi tissutali di diverse specie animali (e umane); scoperto da Buchner (1889). Negli insetti il complemento è assente. Il complemento è una sostanza di natura proteica, di struttura complessa, rapidamente inattivata dal riscaldamento, conservazione prolungata, esposizione a radiazioni ultraviolette, forte agitazione, filtrazione attraverso filtri ceramici, aggiunta di caolino, acidi, alcali, alcool, acetone, cloroformio, distillato acqua, sospensione di batteri, ecc. Il complemento può essere conservato aggiungendo 5 g di solfato di sodio, 4 g di acido borico per 100 ml di siero di cavia. L'attività del complemento viene mantenuta fino a sei mesi. Il modo migliore per conservare è l'essiccazione sottovuoto a bassa temperatura (liofilizzazione). In fiale sigillate in questo stato, viene conservato per due anni. Prima di ogni produzione di RSK, l'attività del complemento viene controllata mediante titolazione, ovvero viene determinato il suo titolo, la quantità ottimale richiesta per questa reazione. Il complemento è titolato due volte: nei sistemi emolitico e batteriolitico.
Per titolazione del complemento nel sistema emolitico vengono preparati i componenti: complemento alla diluizione 1: 20 (1 ml di complemento + 19 ml di soluzione fisiologica); emolisina, diluita secondo il titolo di lavoro; una sospensione di eritrociti di pecora lavati (1: 40), soluzione fisiologica. Le provette vengono poste su un treppiede e in esse vengono versate diverse quantità di complemento con una pipetta graduata ad intervalli di 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: fino a 0,43 ml). Quindi aggiungere i restanti componenti (Fig. 57). Tutte le provette vengono agitate e poste a bagnomaria a 37...38 "C per 10...15 minuti e il risultato viene registrato.
Tenendo conto del risultato: la più piccola quantità di complemento che ha fornito un'emolisi completa (in questo esempio, 0,25 ml) viene presa come titolo del complemento.
Il risultato della titolazione viene preso in considerazione nelle provette con il più alto contenuto di complemento, dove è prevista prima di tutto l'emolisi. Viene chiamata la più piccola quantità di complemento che fornisce l'emolisi completa degli eritrociti in queste condizioni titolo del complemento nel sistema emolitico.
Per titolazione del complemento nel sistema batterioliticoè necessario avere tutti i componenti della reazione: complemento (1:20), eritrociti (1:40), emolisina nel titolo di lavoro, due sieri positivi e due normali, un antigene specifico. I sieri vengono diluiti con soluzione fisiologica 1:10, inattivati per 30 minuti a 56...58 X. Ciascun siero viene versato in due file di provette da 0,5 ml. Il complemento viene aggiunto in quantità crescente alle provette di ciascuna fila, come nella titolazione in un sistema emolitico; iniziare con la quantità prelevata come titolo nel sistema emolitico, poi in ogni provetta successiva la dose viene aumentata di 0,03 ml, livellando il volume a 0,5 ml con soluzione fisiologica.
Successivamente, 0,5 ml di antigene vengono aggiunti a una fila di provette con sieri positivi e normali e 0,5 ml di soluzione fisiologica vengono aggiunti alla seconda fila di ciascun siero. Tutte le provette vengono agitate e poste a bagnomaria per 30-40 min. Quindi, 0,5 ml di emolisina e 0,5 ml di eritrociti vengono aggiunti a tutte le provette, agitate e poste a bagnomaria per 10-15 minuti. La più piccola quantità di complemento che ha assicurato la lisi completa degli eritrociti in entrambe le file di provette (con antigene e senza antigene) di due sieri normali, in una fila (senza antigene) di ciascun siero positivo e con un completo ritardo (assenza) di emolisi in vengono denominate le file di sieri positivi con antigene (in quelli le stesse dosi di complemento). titolo del complemento, che viene utilizzato nella formulazione della principale esperienza di RSC negli studi diagnostici.
L'esperienza principale del RSC (lo studio diagnostico vero e proprio). Due file di provette vengono posizionate nei rack in base al numero di campioni di siero in esame. 0,5 ml di ciascun siero inattivato vengono versati in due provette: un antigene - 0,5 ml viene aggiunto a uno, 0,5 ml di soluzione salina vengono aggiunti all'altro (senza antigene) e, dopo aver aggiunto il complemento, formano un sistema batterilitico, e quindi aggiungere un sistema emolitico.
Componenti richiesti: 1) siero da testare, inattivato, diluito con soluzione fisiologica 1: 10; 2) un antigene specifico diluito secondo il titolo indicato dalla biofabbrica sull'etichetta della confezione; 3) complementare nel titolo stabilito; 4) emolisina nel titolo di lavoro; 5) una sospensione di eritrociti di pecora lavati 1: 40; 6) soluzione salina di NaCl. I sieri di prova vengono versati in due file di provette. Per qualsiasi numero di sieri testati, vengono utilizzati come controlli sieri positivi noti (che danno un risultato positivo) e sieri normali (da un animale sano, che danno un risultato negativo).
Le provette con i componenti del sistema batteriolitico vengono agitate, poste a bagnomaria per 20...40 min a 37...38°C. Le provette del sistema batteriolitico di seconda fila senza antigene vengono agitate, poste a bagnomaria nelle stesse condizioni.
Quindi, i componenti del sistema emolitico vengono aggiunti a tutte le provette della prima e della seconda fila e posti a bagnomaria per una seconda volta per 10..15 minuti. In tutte le provette della seconda fila senza antigene si verifica un'emolisi completa.
Fino al risultato finale, i tubi vengono lasciati a temperatura ambiente per 18 ... .
Le indicazioni della reazione in provetta con sieri di prova sono considerate attendibili se non c'è emolisi in provette con sieri e antigeni positivi, con emolisi completa in provette con siero positivo senza antigene e in tutte le provette con siero normale noto (Fig. 61).
Questa reazione dovrebbe essere accompagnata dai controlli dell'antigene, del complemento, dell'emolisina, degli eritrociti. Per fare ciò, l'antigene con eritrociti di pecora viene versato in provette separate; complemento con eritrociti senza emolisina; emolisina con eritrociti senza complemento; eritrociti e soluzione fisiologica. Il volume in ciascuna provetta viene regolato con soluzione fisiologica a 2,5 ml. Le provette vengono agitate e poste a bagnomaria a 37°C per 20 minuti. Tutte le provette di controllo devono essere prive di emolisi.
Risultato RSC solitamente espresso in crocette. Indicatori di un risultato positivo della reazione: + + + + (///) - completa sedimentazione degli eritrociti (nessuna emolisi), il liquido sopra il sedimento è incolore, + + + (///) - il liquido sopra il sedimento è di colore giallastro appena percettibile. Esito dubbio della reazione: la presenza di eritrociti depositati sul fondo e la parziale colorazione del liquido supernatante dovuta alla lisi di una parte degli eritrociti sono indicati con + + - (++), cioè due e due e un mezze croci. Un'emolisi pronunciata (senza sedimenti) o con un piccolo sedimento (+) è un risultato negativo.
Reazione di fissazione del complemento a lungo termine (RDSC). Più efficace nella sensibilità, in contrasto con il solito RSC classico. L'essenza della reazione è che il sistema batteriolitico viene mantenuto in tre diverse condizioni di temperatura: dopo aver miscelato i componenti a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi a bassa temperatura (4 ° C) in frigorifero per 18 ... 20 ore e a bagnomaria per 15 minuti. Successivamente, il sistema emolitico viene aggiunto, agitato, nuovamente posto a bagnomaria e la reazione viene registrata, come in RSC. L'efficacia di RDSC nella diagnosi di una serie di malattie infettive (tubercolosi, vibriosi, brucellosi, ecc.) è stata confermata.
Reazione di soppressione del legame del complemento (RPSK), o reazione di inibizione, RSK indiretta. Un altro componente è coinvolto in questa reazione: un siero immunitario standard contenente anticorpi contro un antigene solitamente utilizzato per la diagnostica e, pertanto, che reagisce positivamente nella CSC classica.
Il siero da testare viene miscelato con l'antigene e conservato per qualche tempo senza complemento. Quindi vengono aggiunti il complemento e il siero standard, le provette vengono agitate e poste a bagnomaria per 20...30 minuti, dopodiché viene aggiunto il sistema emolitico e rimesso a bagnomaria. Se non c'è emolisi, il risultato è negativo, perché il siero in esame non ha reagito con l'antigene e quest'ultimo ha reagito con il siero standard, legante il complemento. Se il siero del test proviene da un animale malato, contiene anticorpi specifici in relazione all'antigene, cioè si verifica una reazione tra l'antigene e gli anticorpi senza legame con il complemento. L'antigene, interagendo con gli anticorpi del siero in esame, non reagisce (viene soppresso) con il siero standard (ovviamente noto specifico), il complemento rimane libero e reagisce nel sistema emolitico - si verifica l'emolisi, il risultato della reazione è positivo rispetto al siero in esame.
Metodo anticorpi fluorescenti (MFA). Le possibilità di questo metodo sono dovute alla specificità della prima fase delle reazioni sierologiche con elevata sensibilità dell'analisi luminescente. Per l'implementazione dell'MFA, è necessario disporre di sieri immunoluminescenti altamente specifici. È noto che vari test sierologici utilizzati nella pratica microbiologica coinvolgono principalmente tre componenti: antigene batterico, anticorpo e complemento. Tutti e tre i componenti sono, infatti, antigeni e sieri immuni e, di conseguenza, è possibile ottenere anticorpi luminescenti contro ciascuno di essi. A seconda del tipo di siero luminescente utilizzato (contro l'antigene batterico, gli anticorpi antibatterici, il complemento), si distinguono tre varianti principali del metodo dell'anticorpo fluorescente: varianti dirette (1) e indirette (2) e modifica della variante indiretta utilizzando il complemento. La reazione immunologica tra antigene e anticorpo viene effettuata in queste modificazioni direttamente sul vetrino. Per fissare i microrganismi vengono utilizzati solventi organici: acetone, etanolo, metanolo, diossano, nonché fissativi convenzionali utilizzati nella pratica microbiologica: formalina, miscela di Nikiforov, liquido di Carnoy, ecc.
Opzione diretta. Uno specifico siero luminescente viene applicato sulla preparazione finita per un certo tempo, quindi il siero in eccesso viene drenato, la preparazione viene lavata e osservata al microscopio a fluorescenza. Questo metodo viene utilizzato per rilevare i batteri in materiale patologico, oggetti ambientali, nonché per identificare i patogeni nelle colture.
Opzione indiretta (a due stadi). Nella prima fase si verifica una connessione specifica dell'antigene con l'anticorpo corrispondente del siero non marcato. Nella seconda fase, un anticorpo specifico non marcato si lega ad un anticorpo luminescente anti-specie contenuto nel siero di un animale immunizzato con globuline (o siero di sangue intero) della specie animale da cui è stato utilizzato il siero immunitario.
Variante indiretta anticomplementare (a tre fasi). Il primo stadio: la formazione di un complesso anticorpale non marcato con antigene. Secondo passaggio: stratificazione del siero normale contenente complemento. La terza fase: il complesso antigene-anticorpo-complemento viene trattato con siero anti-complementare luminescente preparato durante l'immunizzazione dei conigli con il siero della specie animale che fungeva da fonte del complemento.
Le varianti MFA indirette possono essere utilizzate sia per il rilevamento dell'antigene che per il rilevamento dell'anticorpo. Inoltre, per allestire una variante a due stadi, è necessario disporre di un insieme limitato di sieri luminescenti anti-specie (contro globuline di toro, pecora, cavallo, maiale, ecc.), e per una variante anti-complementare, è sufficiente avere un solo siero luminescente contro le globuline di cavia.
Tecnica e immunoluminescenza e microscopia. Nella pratica dei laboratori batteriologici veterinari vengono utilizzati sieri luminescenti di produzione di biofabbrica. A seconda del tipo di fluorocromo, i sieri luminescenti forniscono un bagliore verde dell'oggetto (un colorante a base fluorescente) o uno rosso (un colorante a base di rodamina).
Per eseguire la microscopia immunoluminescente, il materiale di prova deve essere applicato su un vetrino sgrassato, sottile e privo di graffi. Nello studio di organi e tessuti di animali, le preparazioni-impronte vengono preparate in uno strato sottile. Le preparazioni vengono essiccate all'aria e poste in un liquido di fissaggio (etanolo - 15 min, metanolo - 5 min, acetone - 5 min). Se necessario, dopo il fissaggio, le preparazioni possono essere conservate in frigorifero per qualche tempo. La sequenza e le ulteriori procedure dipendono dal tipo di MFA utilizzato (monostadio, bistadio, tre stadi). Il trattamento delle preparazioni con sieri luminescenti, così come sieri e complemento di prima fase non etichettati, viene effettuato a 37 X in una camera umida (piastre Petri con carta da filtro inumidita).
Opzione a stadio singolo. Il siero luminescente viene applicato su un vetrino con un materiale di prova fisso (nella diluizione indicata sull'ampolla). Il farmaco viene posto in una camera umida per 15...20 minuti a 37 "C. Quindi viene lavato con soluzione salina tamponata (pH 7,4) in un recipiente, cambiando la soluzione dopo 5...10 minuti più volte, o sotto far scorrere acqua di rubinetto per 3...5 minuti L'acqua deve essere neutra e priva di ferro. Quindi la preparazione (possono esserci diverse macchie su un bicchiere) viene asciugata all'aria o con carta da filtro, dopodiché una goccia di glicerolo tamponato con un Viene applicato un pH di 8,0 e coperto con un vetrino coprioggetto Un liquido non fluorescente per immersione viene applicato al vetrino coprioggetto e sottoposto a microscopio.
Opzione a due stadi. Una goccia di siero immune non marcato del primo stadio viene applicata su un vetrino con il materiale di prova. Il farmaco viene posto in un termostato in una camera umida per 15...20 minuti. Quindi viene lavato come sopra descritto, asciugato e viene applicata una goccia di siero antispecie luminescente. Il farmaco viene nuovamente posto in un termostato in una camera umida per 15-20 minuti. Ripetere la procedura di lavaggio e asciugare con carta da filtro. Viene applicato il glicerolo tamponato, coperto con un coprioggetto, viene applicato un liquido di immersione non fluorescente e microscopico.
Variante a tre stadi (anti-complementare). Una goccia di siero immune non marcato del primo stadio viene applicata su un vetrino con il materiale di prova. Il farmaco viene posto in un termostato, come descritto sopra, essiccato e sullo striscio viene applicata una goccia di complemento. Il farmaco viene nuovamente posto in una camera umida e in un termostato per 15...20 minuti, dopodiché viene lavato e viene applicato il siero anticomplementare luminescente. Le procedure successive sono simili all'opzione a una fase.
Preparazione e trattamento dei preparati di controllo. 1. Per l'opzione diretta, al fine di determinare la specificità della reazione tra l'antigene e il siero luminescente, le preparazioni di striscio di specie microbiche eterologhe devono essere trattate con lo stesso siero. Queste specie dovrebbero essere antigenicamente simili, ma differire nella morfologia dai microrganismi studiati; distante in relazione antigenica ai microrganismi studiati, ma simile in morfologia e distribuzione con loro. Le preparazioni per impronte sono trattate con siero normale luminescente.
2. Per la variante indiretta, è necessario disporre di tre preparazioni di controllo trattate con siero normale, siero antispecie luminescente senza siero immune non marcato e siero antispecie luminescente con siero immune noto del primo stadio.
3. Per opzione indiretta con complemento sono richiesti preparati di controllo, durante la lavorazione dei quali il siero immunitario viene sostituito da siero normale dello stesso tipo e nelle stesse diluizioni, nonché preparati trattati con tutti gli ingredienti tranne il siero immunitario.
Valutazione dei risultati. Vengono presi in considerazione la luminosità, il colore, la localizzazione e la struttura del bagliore. I batteri colorati con siero luminescente etichettato con isotiocianato di fluoresceina hanno un bagliore verde brillante attorno alla periferia sotto forma di un bordo o alone, la parte centrale si illumina debolmente. Tale bagliore è chiamato specifico, in contrasto con non specifico, quando l'intero corpo cellulare si illumina in modo uniforme. Quanto più convessa è la cellula batterica nella preparazione, tanto più affilato è il bordo. Questo bagliore può essere spiegato dal fatto che molte volte più anticorpi vengono proiettati sulla retina dell'osservatore da un'area unitaria della "periferia" della cellula che dalla parte centrale della cellula microbica. Va tenuto presente che le cellule plastiche (leptospira, vibrioni) non hanno un contorno o è appena percettibile. Nelle cellule immerse nel fluido tissutale e nei giovani bacilli dell'antrace, il contorno di solito non è nettamente espresso.
L'intensità della luminescenza viene valutata secondo il sistema a quattro croci: + + + + - fluorescenza molto brillante lungo la periferia della cellula microbica, in netto contrasto con il corpo scuro della cellula; + + + - brillante fluorescenza della periferia cellulare; + + - debole bagliore della periferia cellulare; + - nessun bagliore di contrasto della periferia del corpo cellulare microbico. L'assenza di un bagliore specifico è indicata da "-" (sono visibili ombre di microrganismi). Quando si diagnosticano vari agenti patogeni un risultato positivo molto spesso, la luminescenza specifica delle cellule batteriche è considerata non inferiore a quattro o tre croci.
Il libro di testo si compone di sette parti. La prima parte - "Microbiologia generale" - contiene informazioni sulla morfologia e fisiologia dei batteri. La seconda parte è dedicata alla genetica dei batteri. La terza parte - "Microflora della biosfera" - considera la microflora dell'ambiente, il suo ruolo nel ciclo delle sostanze in natura, così come la microflora umana e il suo significato. La quarta parte - "La dottrina dell'infezione" - è dedicata alle proprietà patogene dei microrganismi, al loro ruolo nel processo infettivo e contiene anche informazioni sugli antibiotici e sui loro meccanismi d'azione. La quinta parte - "La dottrina dell'immunità" - contiene idee moderne sull'immunità. La sesta parte - "I virus e le malattie che causano" - fornisce informazioni sulle principali proprietà biologiche dei virus e sulle malattie che provocano. Parte sette - "Microbiologia medica privata" - contiene informazioni sulla morfologia, fisiologia, proprietà patogene dei patogeni di molti malattie infettive, così come circa metodi moderni loro diagnosi, prevenzione specifica e terapia.
Il libro di testo è destinato a studenti, dottorandi e insegnanti di istituti di istruzione medica superiore, università, microbiologi di tutte le specialità e professionisti.
5a edizione riveduta e ampliata
Libro:
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Reazione di fissazione del complemento
La capacità unica del complemento di legarsi specificamente a complessi antigene + anticorpo di diversa natura ha trovato ampia applicazione nella reazione di fissazione del complemento (CFR). Un vantaggio particolare di CSC è che la natura dell'antigene in esso coinvolto (corpuscolare o solubile) non ha importanza, poiché il complemento si lega al frammento Fc di qualsiasi anticorpo correlato a IgG e IgM, indipendentemente dalla sua specificità anticorpale. Inoltre, CSC è molto sensibile: consente di rilevare la quantità di anticorpi 10 volte inferiore rispetto, ad esempio, alla reazione di precipitazione. RSC fu proposto nel 1901 da J. Bordet e O. Zhang. Si basa su due proprietà del complemento:
1) la capacità di legarsi al complesso antigene + anticorpo;
2) lisi degli eritrociti utilizzati per ottenere siero emolitico.
RSK è suddiviso in due fasi e vi partecipano rispettivamente due sistemi: sperimentale o diagnostico e indicatore. Il sistema diagnostico è costituito dal siero test (o diagnostico), che viene riscaldato a 56°C per 30 minuti prima che si imposti la reazione per inattivare il complemento in esso presente, e dall'antigene. A questo sistema viene aggiunto un complemento standard. La sua fonte è il siero di cavia fresco o essiccato. La miscela viene incubata a 37°C per un'ora. Se sono presenti anticorpi nel siero del test, essi interagiranno con l'antigene aggiunto ei complessi antigene + anticorpo risultanti legheranno il complemento aggiunto. Se non ci sono anticorpi nel siero, la formazione del complesso antigene + anticorpo non si verificherà e il complemento rimarrà libero. Di solito non ci sono manifestazioni visibili di fissazione del complemento in questa fase della reazione. Pertanto, per chiarire la questione se si sia verificata o meno la fissazione del complemento, viene aggiunto un secondo sistema indicatore (siero emolitico inattivato + eritrociti di ariete) e la miscela di tutti i componenti CSC viene nuovamente incubata a 37 ° C per 30-60 min, dopodiché vengono valutati i risultati della reazione. Se il complemento è legato al primo stadio, nel sistema diagnostico, cioè ci sono anticorpi nel siero del paziente, e il complemento è stato legato dal complesso anticorpo + antigene, non ci sarà lisi degli eritrociti - RSC è positivo: il liquido è incolore, il sedimento eritrocitario si trova sul fondo della provetta. Se non ci sono anticorpi specifici nel siero e il legame del complemento non si verifica nel sistema diagnostico, cioè RSK è negativo, allora il complemento non consumato nel sistema diagnostico si lega al complesso di eritrociti + anticorpi del sistema indicatore e si verifica l'emolisi: nella provetta "sangue laccato", sedimento eritrocitario n. L'intensità di CSC è valutata da un sistema a quattro croci, a seconda del grado di ritardo dell'emolisi e della presenza di sedimento eritrocitario. La reazione è accompagnata da controlli appropriati: controllo del siero (nessun antigene) e controllo dell'antigene (nessun siero), in quanto alcuni sieri e alcuni antigeni hanno effetti anti-complementari. Prima di impostare RSK, tutti i componenti coinvolti in esso, ad eccezione del siero o dell'antigene studiato, vengono accuratamente titolati. È particolarmente importante introdurre nella reazione la dose esatta di complemento, poiché la sua carenza o eccesso può portare a risultati falsi. Il titolo del complemento è la quantità minima che, in presenza di una dose di lavoro di siero emolitico, assicura la completa dissoluzione degli eritrociti. Per impostare l'esperimento principale, viene prelevata una dose di complemento, aumentata del 20-25% rispetto al titolo stabilito. Il titolo del siero emolitico è la sua massima diluizione, che, se miscelata con un volume uguale di soluzione di complemento al 10%, emolizza completamente la dose corrispondente di globuli rossi entro 1 ora a una temperatura di 37 ° C. Il siero diluito a 1/3 del suo titolo viene utilizzato nell'esperimento principale.