واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) روشی بسیار دقیق برای تشخیص عوامل عفونی خاص است. تجزیه و تحلیل PCR - چیست: چگونه و کجا پرایمر برای PCR اهدا کنیم

پلیمراز واکنش زنجیره ای(PCR)- یک روش تجربی از زیست شناسی مولکولی، که یک تقویت خاص اسیدهای نوکلئیک القا شده توسط آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی مصنوعی است. درونکشتگاهی.

ایده توسعه روش PCR متعلق به محقق آمریکایی Kary Mullis است، که در سال 1983 روشی را ایجاد کرد که امکان تکثیر DNA را در طی تکرارهای حلقوی با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز در شرایط مصنوعی ایجاد کرد. چند سال پس از انتشار این ایده، در سال 1993، K. Mullis جایزه نوبل را برای آن دریافت کرد.

در ابتدای استفاده از روش، پس از هر چرخه گرمایش و سرمایش، لازم بود DNA پلیمراز به مخلوط واکنش اضافه شود، زیرا زمانی که به سرعت غیرفعال می شد. درجه حرارت بالا. این روش بسیار ناکارآمد بود و به زمان و آنزیم زیادی نیاز داشت. در سال 1986، با استفاده از DNA پلیمراز از باکتری های گرمادوست به طور قابل توجهی اصلاح شد. این آنزیم ها قادر به تحمل چرخه های واکنش بسیاری هستند که امکان خودکارسازی PCR را فراهم می کند. یکی از متداول ترین DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت، از باکتری ها جدا شد ترموس آبیو نام برد طاق-DNA پلیمراز

ماهیت روش.این روش بر اساس کپی انتخابی مکرر یک بخش DNA خاص با استفاده از آنزیم Taq DNA پلیمراز است. واکنش زنجیره ای پلیمراز به فرد امکان می دهد تقویت کننده هایی با طول چند هزار جفت باز بدست آورد. برای افزایش طول محصول PCR به 20-40 هزار جفت باز، از مخلوطی از پلیمرازهای مختلف استفاده می شود، اما این هنوز به طور قابل توجهی کمتر از طول DNA کروموزومی یک سلول یوکاریوتی است.

واکنش در یک ترموستات قابل برنامه ریزی (تقویت کننده) انجام می شود - دستگاهی که می تواند بسیار سریع انجام شود.

سرمایش و گرمایش لوله های آزمایش (معمولاً با دقت حداقل 0.1 درجه سانتیگراد). آمپلی فایرها به شما امکان می دهند برنامه های پیچیده از جمله امکان "شروع داغ" و ذخیره سازی بعدی را تنظیم کنید. برای PCR بلادرنگ، دستگاه‌های مجهز به آشکارساز فلورسنت تولید می‌شوند. همچنین دستگاه هایی با درب اتوماتیک و محفظه ای برای میکروپلیت ها وجود دارد که به آنها اجازه می دهد تا در سیستم های خودکار ادغام شوند.

به طور معمول، هنگام انجام PCR، 20-45 چرخه انجام می شود که هر یک از سه مرحله تشکیل شده است: دناتوراسیون، بازپخت پرایمر، ازدیاد طول (شکل 6.1 و 6.2). در شکل شکل 6.1 دینامیک تغییرات دما در لوله آزمایش را در طول چرخه PCR نشان می دهد.

برنج. 6.1.نمودار تغییرات دما در یک لوله آزمایش در طول یک چرخه واکنش زنجیره ای پلیمراز

دناتوره سازی الگوی DNAبا حرارت دادن مخلوط واکنش به 94-96 درجه سانتیگراد به مدت 5-90 ثانیه انجام می شود تا زنجیره های DNA از هم جدا شوند. لازم به ذکر است که قبل از چرخه اول، مخلوط واکنش به مدت 2-5 دقیقه از قبل گرم می شود تا ماتریس شروع به طور کامل دناتوره شود، که باعث می شود مقدار محصولات واکنش غیر اختصاصی کاهش یابد.

برنج. 6.2.طرح دور اول واکنش زنجیره ای پلیمراز

مرحله بازپخت پرایمر.با کاهش تدریجی دما، پرایمرها به طور مکمل به ماتریس متصل می شوند. دمای بازپخت به ترکیب پرایمرها بستگی دارد و معمولاً 4-5 درجه کمتر از دمای ذوب محاسبه شده است. مدت زمان مرحله 5-60 ثانیه است.

در مرحله بعدی - طویل شدن- سنتز رشته DNA دختر روی ماتریکس مادر اتفاق می افتد. دمای ازدیاد طول به پلیمراز بستگی دارد. DNA پلیمرازهای رایج مورد استفاده Taq و Pfu در دمای 72 درجه سانتیگراد فعال هستند. زمان ازدیاد طول، که عمدتاً به طول محصول PCR بستگی دارد، معمولاً 1 دقیقه در هزار جفت باز است.

GOU VPO "آکادمی پزشکی دولتی کراسنویارسک"

به نام یاسنتسکی آژانس فدرالبهداشت و توسعه اجتماعی"

گروه ژنتیک پزشکی و نوروفیزیولوژی بالینی IPO

اصول اساسی روش

واکنش زنجیره ای پلیمراز

راهنمای روش شناسی برای دانش آموزان 3-4 ساله

در تخصص های پزشکی عمومی (060101) و

کراسنویارسک - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. اصول اساسی روش واکنش زنجیره ای پلیمراز. راهنمای روش کار فوق برنامه دانش آموزان 3-4 ساله در تخصص های پزشکی عمومی (060101) و اطفال (060103). - کراسنویارسک: انتشارات مؤسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای KrasSMA، 2007. - 42 ص.

کتابچه راهنمای روش شناسی به طور کامل با الزامات استاندارد دولتی (2000) مطابقت دارد و جنبه های اصلی را منعکس می کند. روش مدرنتشخیصی بیماری های ارثیروش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انسانی، مطالب آموزشی متناسب با فن آوری های آموزشیبا در نظر گرفتن ویژگی های آموزش در 3-4 سال دانشکده های پزشکی و اطفال.

داوران:رئیس گروه ژنتیک پزشکی مؤسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای

"دانشگاه پزشکی دولتی نووسیبیرسک آژانس فدرال بهداشت و توسعه اجتماعی"، دکترای علوم پزشکی، پروفسور؛

همانندسازی DNA

هدف مطالعه این روش دی اکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) است. DNA حامل جهانی اطلاعات ژنتیکی در تمام موجودات موجود بر روی زمین (به استثنای میکروارگانیسم های حاوی RNA) است. DNA یک رشته دوتایی است که به شکل مارپیچ پیچیده شده است. هر رشته شامل نوکلئوتیدهایی است که به ترتیب به هم متصل شده اند. رشته های DNA دارای جهت مخالف هستند: انتهای 5 اینچی یک رشته با انتهای 3 اینچی رشته دوم مطابقت دارد. ویژگی منحصر به فرد DNA توانایی آن در دو برابر شدن است. این فرآیند نامیده می شود همانند سازی. همانندسازی مولکول DNA در طول دوره مصنوعی اینترفاز اتفاق می افتد. هر یک از دو زنجیره مولکول "مادر" به عنوان الگویی برای "دختر" عمل می کند. پس از تکثیر، مولکول DNA تازه سنتز شده حاوی یک رشته "مادر" است و دومی یک رشته "دختری" تازه سنتز شده است (روش نیمه محافظه کارانه). برای سنتز الگوی یک مولکول DNA جدید، لازم است که مولکول قدیمی خارج شده و کشیده شود. همانندسازی از چندین مکان در مولکول DNA آغاز می شود. بخشی از یک مولکول DNA از نقطه شروع یک همانندسازی تا نقطه شروع دیگری نامیده می شود replicon.

شروع تکرار فعال می شود آغازگرها(پرایمرها) متشکل از 100-200 جفت نوکلئوتیدی. آنزیم DNA هلیکاز باز می شود و مارپیچ DNA مادر را به دو رشته تقسیم می کند، که بر اساس اصل مکملیت، با مشارکت آنزیم DNA پلیمراز، رشته های DNA "دختری" جمع می شوند. برای اینکه آنزیم کار خود را آغاز کند، وجود یک بلوک شروع - یک قطعه اولیه دو رشته ای کوچک - لازم است. بلوک شروع از تعامل پرایمر با ناحیه مکمل رشته متناظر DNA مادر تشکیل می شود. در هر رپلیکون، DNA پلیمراز می تواند در امتداد رشته "مادر" تنها در یک جهت حرکت کند (5`=>3`).

در رشته پیشرو، با باز شدن رپلیکون، یک رشته "دختری" به تدریج به طور مداوم رشد می کند. در رشته عقب مانده، رشته دختر نیز در جهت (5`=>3`) سنتز می شود، اما با باز شدن رپلیکون در قطعات جداگانه.

بنابراین، افزودن نوکلئوتیدهای مکمل رشته های "دختری" در جهت مخالف (ضد موازی) اتفاق می افتد. همانندسازی در همه رپلیکون ها به طور همزمان اتفاق می افتد. قطعات و بخش‌هایی از رشته‌های «دختری» که در شبیه‌سازی‌های مختلف سنتز شده‌اند، توسط آنزیم لیگاز به یک رشته دوخته می‌شوند. همانندسازی با نیمه محافظه کاری، ضد موازی و ناپیوستگی مشخص می شود. کل ژنوم یک سلول یک بار در طول یک دوره زمانی مربوط به یک چرخه میتوزی تکثیر می شود. در نتیجه فرآیند همانند سازی، دو مولکول DNA از یک مولکول DNA تشکیل می شود که در آن یک رشته از مولکول DNA مادر است و رشته دوم، دختر، به تازگی سنتز شده است (شکل 1).

برنج. 1. طرح تکثیر مولکول DNA.

بنابراین، چرخه تکثیر DNA شامل سه مرحله اصلی:

1. باز شدن مارپیچ DNA و واگرایی رشته ها (دناتوره شدن).

2. اتصال آغازگرها.

3. تکمیل زنجیره نخ کودک.

اصل روش PCR

این تکثیر DNA است که اساس PCR را تشکیل می دهد. در PCR، فرآیندهای فوق در یک لوله آزمایش در حالت چرخه ای انجام می شود. انتقال از یک مرحله واکنش به مرحله دیگر با تغییر دمای مخلوط جوجه کشی حاصل می شود. هنگامی که محلول تا دمای 95-93 درجه سانتیگراد گرم می شود، دناتوره شدن DNA رخ می دهد. برای ادامه مرحله بعدی - افزودن یا "پخت" پرایمرها - مخلوط جوجه کشی تا 50-65 درجه سانتیگراد خنک می شود. سپس مخلوط تا دمای 70-72 درجه سانتیگراد گرم می شود - عملیات بهینه taq-DNA پلیمراز - در این مرحله یک رشته DNA جدید تکمیل می شود. سپس چرخه دوباره تکرار می شود. به عبارت دیگر روش PCR افزایش چند برابری در تعداد کپی است (تقویت) بخش خاصی از DNA که توسط آنزیم DNA پلیمراز کاتالیز می شود.

رشد رشته های DNA دختر باید به طور همزمان در هر دو رشته DNA مادر اتفاق بیفتد، بنابراین همانند سازی رشته دوم نیز به پرایمر خود نیاز دارد. بنابراین، دو آغازگر به مخلوط واکنش اضافه می شود: یکی برای زنجیره "+"، دوم برای زنجیره "-". پرایمرها با اتصال به رشته های مخالف مولکول DNA، خود را به بخشی از آن محدود می کنند که متعاقباً چندین بار تکرار یا تقویت می شود. طول چنین قطعه ای که آمپلیکون نامیده می شود معمولاً چند صد نوکلئوتید است.

مراحل PCR

هر چرخه تقویت شامل 3 مرحله است که در مراحل مختلف رخ می دهد شرایط دمایی(شکل 2).

· مرحله ی 1:دناتوره شدن DNA . در 93-95 درجه به مدت 30-40 ثانیه رخ می دهد.

· مرحله 2:پرایمر آنیلینگ . اتصال پرایمرها مکمل توالی های متناظر روی رشته های DNA مخالف در مرزهای یک منطقه خاص است. هر جفت پرایمر دمای بازپخت مخصوص به خود را دارد که مقادیر آن در محدوده 50-65 درجه سانتیگراد است. زمان بازپخت 20-60 ثانیه

· مرحله 3:تکمیل زنجیره‌های DNA تکمیل زنجیره‌های DNA از انتهای 5 اینچی تا انتهای 3 اینچی زنجیره در جهت‌های مخالف، از محل‌های اتصال پرایمر شروع می‌شود. ماده برای سنتز زنجیره های DNA جدید، تری فسفات های دئوکسی ریبونوکلئوزیدی است که به محلول اضافه می شود. فرآیند سنتز توسط آنزیم taq polymerase کاتالیز می شود و در دمای 70-72 درجه سانتی گراد انجام می شود. زمان سنتز 20-40 ثانیه است.

زنجیره های DNA جدید تشکیل شده در اولین چرخه تقویت به عنوان الگو برای چرخه تقویت دوم، که در آن یک قطعه آمپلیکون DNA خاص تشکیل می شود، عمل می کند (شکل 3). در چرخه های تقویت بعدی، آمپلیکون ها به عنوان الگویی برای سنتز زنجیره های جدید عمل می کنند.

بنابراین، تجمع آمپلیکون‌ها در محلول طبق فرمول 2 اتفاق می‌افتد، که در آن n تعداد چرخه‌های تقویت است. بنابراین، حتی اگر محلول اولیه در ابتدا فقط یک مولکول DNA دو رشته‌ای داشته باشد، در 30-40 سیکل حدودا 108 مولکول آمپلیکون در محلول انباشته می شود که این مقدار برای تشخیص بصری قابل اعتماد این قطعه توسط الکتروفورز ژل آگارز کافی است.

فرآیند تقویت در یک ترموستات ویژه قابل برنامه ریزی ( سیکلر حرارتی) که طبق یک برنامه داده شده، به طور خودکار دما را با توجه به تعداد چرخه های تقویت تغییر می دهد.

برای انجام تقویت، اجزای زیر مورد نیاز است:

· ماتریس DNA(DNA یا بخشی از آن حاوی قطعه خاص مورد نظر)؛

· آغازگرها(الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی (20-30 جفت نوکلئوتید)، مکمل توالی‌های DNA در مرزهای قطعه خاص در حال تعیین). انتخاب یک قطعه خاص و انتخاب پرایمرها نقش مهمی در ویژگی تقویت دارد که بر کیفیت آنالیز تأثیر می گذارد.

· مخلوطی از دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTPs)(مخلوطی از چهار dNTP که ماده ای برای سنتز زنجیره های DNA مکمل جدید در غلظت های معادل 200-500 میکرومولار هستند)

· آنزیمطاق-پلیمراز(DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت که با افزودن متوالی بازهای نوکلئوتیدی به زنجیره در حال رشد DNA سنتز شده، 2-3 میلی مولار، طویل شدن زنجیره های آغازگر را کاتالیز می کند).

· محلول بافر(محیط واکنش حاوی یونهای Mg2+ لازم برای حفظ فعالیت آنزیم، pH 6.8-7.8).

برای شناسایی مناطق خاصی از ژنوم ویروس‌های RNA، ابتدا یک کپی DNA از یک الگوی RNA با استفاده از واکنش رونویسی معکوس (RT) که توسط آنزیم ریورتاز (ترانس کریپتاز معکوس) کاتالیز می‌شود، به دست می‌آید.

برنج. 2. تقویت (سیکل 1).

برنج. 3. تقویت (دومین سیکل).

کاربردهای اصلی PCR

· پزشکی بالینی:

o تشخیص عفونت ها

o تشخیص جهش ها، از جمله تشخیص بیماری های ارثی،

o تعیین ژنوتیپ، از جمله ژنوتیپ HLA،

o فناوری های سلولی

· اکولوژی (به عنوان راهی برای نظارت بر وضعیت و کیفیت اشیاء محیطی و محصولات غذایی)

· تعیین موجودات تراریخته (GMOs)

شناسایی شخصی، استقرار پدری، پزشکی قانونی

· زیست شناسی عمومی و اختصاصی،

اصول اساسی

سازماندهی آزمایشگاه های تشخیصی

کار در آزمایشگاه PCR مطابق با "قوانین طراحی، اقدامات احتیاطی ایمنی، بهداشت صنعتی، رژیم ضد اپیدمی و بهداشت شخصی هنگام کار در آزمایشگاه ها (بخش ها، بخش ها) موسسات بهداشتی و اپیدمیولوژیک سیستم مراقبت های بهداشتی انجام می شود.

آلودگی نمونه های DNA

انجام تشخیص PCR به دلیل حساسیت بالای روش با مشکل همراه است - امکان آلودگی. ورود مقادیر کمی از DNA مثبت به لوله واکنش (محصولات تقویت DNA خاص - آمپلیکن ها؛ استاندارد DNA استفاده شده به عنوان کنترل مثبت؛ DNA مثبت از نمونه بالینی) منجر به تکثیر یک قطعه DNA خاص در طی PCR و در نتیجه می شود. ، به ظاهر نتایج مثبت کاذب.

در طول کار ممکن است با آن مواجه شوید دو نوع آلودگی:

1. آلودگی متقابلاز نمونه ای به نمونه دیگر (در طول پردازش نمونه های بالینی یا هنگام حل کردن مخلوط واکنش)، که منجر به نتایج مثبت کاذب پراکنده می شود.

2. آلودگی با محصولات تقویت کننده(آمپلیکون) داشتن بالاترین ارزشزیرا در طول فرآیند PCR، آمپلیکون ها در مقادیر زیادی جمع می شوند و محصولات ایده آلی برای تقویت مجدد هستند.

آلودگی ظروف شیشه‌ای، پیپت‌های خودکار و تجهیزات آزمایشگاهی، سطح نیمکت‌های آزمایشگاه یا حتی سطح پوست کارکنان آزمایشگاه با مقادیر کمی آمپلیکون منجر به نتایج سیستماتیک مثبت کاذب می‌شود. تعیین منبع آلودگی می تواند بسیار دشوار باشد و نیاز به سرمایه گذاری قابل توجهی در زمان و هزینه دارد. تجربه به دست آمده تا به امروز در آزمایشگاه ها با استفاده از روش PCR برای تشخیص به ما امکان می دهد الزامات اساسی برای سازماندهی چنین آزمایشگاه ها و انجام خود آنالیزها را تدوین کنیم. رعایت این الزامات احتمال آلودگی و نتایج مثبت کاذب را از بین می برد.

مراحل آنالیز PCR

آنها از نظر جغرافیایی با قرار دادن آنها در اتاق های جداگانه جدا می شوند (شکل 4 و 5):

· اتاق قبل از PCR،در جایی که نمونه‌های بالینی پردازش می‌شوند، DNA جدا می‌شود، یک مخلوط واکنش برای PCR تهیه می‌شود و PCR انجام می‌شود (در صورت وجود شرایط، دو مرحله آخر نیز توصیه می‌شود در یک اتاق جداگانه دیگر انجام شود). در این مکان ها، انجام سایر انواع کار با عوامل آزمایش که تشخیص PCR در این آزمایشگاه انجام می شود، ممنوع است.

· اتاق بعد از PCRجایی که تشخیص محصولات تقویتی انجام می شود. در این اتاق می‌توان از روش‌های تشخیص دیگری استفاده کرد. توصیه می شود اتاق تشخیص محصول تقویت را تا آنجا که ممکن است از اتاق های قبل از PCR قرار دهید.

اتاق های کار مجهز به لامپ های فرابنفش با حداکثر تابش در منطقه 260 نانومتر (نوع DB-60) با نرخ 2.5 وات در هر متر مکعب هستند. لامپ ها به گونه ای قرار گرفته اند که سطوح میز کار، تجهیزات و موادی که اپراتور با آنها در حین آنالیز PCR تماس دارد در معرض تابش مستقیم قرار گیرد. تابش 1 ساعت قبل از شروع کار و ظرف 1 ساعت پس از اتمام کار انجام می شود.

پزشکان آزمایشگاه با لباس های مخصوص آزمایشگاهی که هنگام جابجایی از اتاقی به اتاق دیگر تعویض می شوند و با دستکش های یکبار مصرف کار می کنند. لباس های اتاق های مختلف به طور جداگانه پردازش می شوند. کارمندان مختلف در مراحل مختلف تجزیه و تحلیل PCR کار می کنند.

برای کار، از مجموعه های جداگانه تلگراف، ظروف پلاستیکی و شیشه ای، تجهیزات آزمایشگاهی، روپوش و دستکش استفاده می شود که برای مراحل مختلف تجزیه و تحلیل در نظر گرفته شده است و از یک اتاق به اتاق دیگر قابل حمل نیستند. تجهیزات، مواد و لوازم موجود در هر اتاق به طور مناسب علامت گذاری شده است.

تمام مراحل کار فقط با استفاده از مواد مصرفی یکبار مصرف انجام می شود: راهنمایی برای پیپت های اتوماتیک، لوله های آزمایش، دستکش و غیره. هنگام جابجایی از نمونه به نمونه، حتماً نوک ها را تغییر دهید. برای جلوگیری از ورود ریز قطرات محلول به پیپت، لازم است از نوک هایی با فیلتر - یک مانع آئروسل استفاده کنید. لوله ها و نوک های استفاده شده در ظروف مخصوص یا ظروف حاوی محلول ضدعفونی کننده ریخته می شوند. نمونه های بالینی جدا از معرف ها ذخیره می شوند.

برای پردازش و تمیز کردن محل کار، هر اتاق مجهز به سواب های پنبه ای (دستمال مرطوب)، موچین، محلول های ضد عفونی کننده و غیرفعال کننده است.

آزمایشگاه تشخیص PCR کارهای مربوط به تولید (کلونینگ) و جداسازی پلاسمیدهای نوترکیب حاوی توالی های DNA یا قطعات ژنی پاتوژن هایی که در این آزمایشگاه تشخیص داده می شوند را مستثنی می کند.

مجموعه مطالب بالینی

مواد مورد مطالعه برای PCR می تواند خراش دادن سلول های اپیتلیال، خون، پلاسما، سرم، مایعات جنب و مغزی نخاعی، ادرار، خلط، مخاط و سایر ترشحات بیولوژیکی، بیوپسی باشد.

مواد در یک اتاق درمان با مشخصات مناسب جمع آوری می شود. پس از جمع آوری، نمونه ها باید در اسرع وقت به آزمایشگاه تشخیصی PCR تحویل داده شوند.

نمونه‌ها باید با استفاده از ابزار استریل، ترجیحاً یکبار مصرف، فقط در لوله‌های پلاستیکی استریل یکبار مصرف یا لوله‌های شیشه‌ای، قبل از درمان به مدت یک ساعت با مخلوط کروم، کاملاً با آب مقطر شسته شده و در کابینت خشک کن در دمای 150 درجه سانتی‌گراد کلسینه شوند. به مدت 1 ساعت.

منطقه تشخیص (طبقه دیگر یا ساختمان دیگر).

برنج. 4. دستگاه آزمایشگاهی PCR با تشخیص الکتروفورز.

منطقه تشخیص (طبقه دیگر یا ساختمان دیگری)

برنج. 5. دستگاه آزمایشگاهی PCR با تشخیص فلورسنت (تحلیل کمی).

برنج. 6. اتاق استخراج DNAیک جعبه رومیزی با یک لامپ میکروب کش نشان داده شده است.

برنج. 7. اتاق تقویت

برنج. 8. اتاق تشخیص

برنج. 9. نمونه خون برای تشخیص DNA بیماری های ارثی.

ذخیره سازی و حمل و نقل نمونه

برای تشخیص بیماری های ارثی، نمونه های خون در قالب های کاغذی مخصوص یا در اپیندورف (لوله های پلاستیکی) در حالت یخ زده برای مدت طولانی نگهداری می شوند (شکل 9).

برای تشخیص بیماری های عفونینمونه ها بیش از 2 ساعت در دمای اتاق نگهداری می شوند. در صورت نیاز به نگهداری طولانی‌تر، نمونه‌ها را می‌توان در یخچال با دمای 2 تا 8 درجه سانتی‌گراد به مدت حداکثر یک روز قرار داد. نگهداری طولانی تر (تا 2 هفته) در فریزر در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد منجمد مجاز است. انجماد و ذوب مکرر نمونه ها مجاز نیست.

اگر آزمایشگاه تشخیص PCR و اتاق روش نمونه برداری از نظر جغرافیایی از هم جدا باشند، حمل و نقل نمونه ها باید در قمقمه یا ظروف حرارتی با رعایت قوانین نگهداری نمونه ها و قوانین حمل و نقل مواد عفونی انجام شود.

استخراج DNA از نمونه ها

روش جذب فاز جامد گسترده شده است، که شامل افزودن یک عامل لیز حاوی محلول گوانیدین، جذب DNA روی جاذب، شستشوی مکرر و جذب DNA با محلول بافر است. هنگام پردازش سرم، پلاسما یا خون کامل، معمولاً از روش استخراج فنل استفاده می شود. این روش شامل پروتئین زدایی با فنل/کلروفرم و به دنبال آن رسوب DNA (یا RNA) با اتانول یا ایزوپروپانول است. پردازش در لوله های میکروسانتریفیوژ Eppendor P با حجم 1.5 میلی لیتر انجام می شود. زمان پردازش 1.5-2 ساعت است (شکل 10).

برنج. 10. استخراج DNA

انجام PCR

مقدار مشخصی از نمونه بالینی پردازش شده به یک لوله میکروسانتریفیوژ مخصوص از نوع اپندورف با حجم 0.2 یا 0.5 میلی لیتر منتقل می شود. همان لوله Taq (آخرین به مخلوط اضافه می شود) به طور معمول، حجم مخلوط واکنش 25 میکرولیتر است، سپس یک قطره روغن معدنی در طول فرآیند تقویت لوله ها اضافه می شود به یک ترموستات قابل برنامه ریزی (تقویت کننده) منتقل می شوند، جایی که تقویت به طور خودکار طبق یک برنامه مشخص انجام می شود (شکل 11).

برنج. یازده تقویت کننده " ترموسایکلر ».

زمان واکنش بسته به برنامه مشخص شده 2-3 ساعت است. به موازات نمونه های آزمایشی، نمونه های کنترل قرار می گیرند: کنترل مثبت شامل تمام اجزای واکنش است، اما به جای مواد نمونه بالینی، یک آماده سازی DNA کنترل از ژن مورد مطالعه اضافه می شود. کنترل منفی شامل تمام اجزای واکنش است، اما به جای مواد بالینی یا آماده سازی DNA، مقدار مناسبی از آب دیونیزه یا عصاره ای که حاوی DNA مورد آزمایش نیست، اضافه می شود. کنترل منفی برای بررسی اجزای واکنش از نظر عدم وجود DNA به دلیل آلودگی و حذف نتایج مثبت کاذب ضروری است.

ثبت نتایج

قطعه DNA اختصاصی تقویت شده توسط الکتروفورز ژل آگارز در حضور اتیدیوم بروماید شناسایی می شود. اتیدیوم بروماید یک ترکیب بینابینی پایدار با قطعات DNA را تشکیل می دهد که وقتی ژل با تابش اشعه ماوراء بنفش با طول موج 290-330 نانومتر تحت تابش ژل قرار می گیرد، به شکل نوارهای درخشان ظاهر می شود. بسته به اندازه آمپلیکون های تشکیل شده در نتیجه PCR، از ژل با محتوای آگارز 1.5٪ تا 2.5٪ استفاده می شود. برای تهیه ژل آگارز، مخلوطی از آگارز، بافر و آب را در اجاق مایکروویو یا در حمام آب ذوب کرده و محلولی از اتیدیوم بروماید را به آن اضافه می کنند. مخلوطی که تا دمای 60-50 درجه سانتیگراد خنک شده، در لایه ای به ضخامت 6-4 میلی متر در قالب ریخته شده و با استفاده از شانه های مخصوص، جیب هایی در ژل برای استفاده از نمونه ایجاد می شود. نصب شانه ها به گونه ای است که یک لایه آگارز 0.5-1 میلی متری بین کف چاهک ها و پایه ژل باقی می ماند. پس از سفت شدن ژل، تقویت کننده به مقدار 5-15 میکرولیتر روی پاکت ها اعمال می شود. انجام الکتروفورز مخلوطی از نشانگرهای طول قطعه DNA به موازات نمونه های شاهد و آزمایشی توصیه می شود. به طور معمول، چنین مخلوطی حاوی ده قطعه DNA به طول 100، 200، 300 و غیره جفت باز است.

استفاده از چنین آزمونی امکان بررسی طول آمپلیکون ها را در نمونه های کنترل و آزمایشی ممکن می سازد. ژل با نمونه اعمال شده به یک محفظه الکتروفورز پر از بافر منتقل می شود، محفظه به یک منبع تغذیه متصل می شود و جداسازی الکتروفورتیک محصولات تقویت به مدت 30-45 دقیقه با شدت میدان الکتریکی 10-15 V / انجام می شود. سانتی متر. در این حالت، قسمت جلویی رنگ موجود در مخلوط واکنش باید حداقل 3 سانتی متر حرکت کند.

پس از اتمام الکتروفورز، ژل به یک ترانسیلمیناتور شیشه ای منتقل می شود و در زیر نور ماوراء بنفش مشاهده می شود. برای مستندسازی، ژل بر روی فیلم Micrat 300 عکس گرفته می شود یا با استفاده از یک سیستم ویدئویی متصل به کامپیوتر ضبط می شود.

ابتدا نمونه های کنترل مورد ارزیابی قرار می گیرند. یک نوار درخشان نارنجی باید در مسیر الکتروفورتیک مربوط به کنترل مثبت وجود داشته باشد. تحرک الکتروفورتیک آن باید با طول آمپلیکون مشخص شده در دستورالعمل مطابقت داشته باشد.

در مسیر الکتروفورتیک مربوط به کنترل منفی، چنین باندی باید وجود نداشته باشد. وجود چنین باندی در کنترل منفی نشان دهنده آلودگی - آلودگی معرف های مورد استفاده با DNA یا آمپلیکون آزمایشی است. نمونه های آزمایشی با وجود نواری در مسیر مربوطه ارزیابی می شوند که در همان سطح باند در نمونه کنترل مثبت قرار دارد. شدت باند مربوط به مقدار DNA مورد آزمایش در نمونه است که امکان ارزیابی نیمه کمی PCR را فراهم می کند. معمولا نتایج مثبتدر مقیاس چهار درجه ای رتبه بندی شده است. اگر درخشش باند در نمونه آزمایشی بسیار ضعیف باشد، چنین نمونه ای باید دوباره مرتب شود (شکل 12).

برنج. 12. الکتروفورز ژل آگارز.

کاربردهای PCR برایتشخیص جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم های ژنی

یکی از زمینه های پیشرو در کاربرد PCR در مراقبت های بهداشتی عملی، تشخیص جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم های ژنی است. . روش های مستقیم و غیرمستقیم برای تشخیص DNA وجود دارد. در شرایطی که ژنی شناخته شده است که آسیب به آن منجر به ایجاد یک بیماری ارثی می شود، این آسیب با روش های ژنتیک مولکولی قابل تشخیص است. چنین روش هایی مستقیم نامیده می شوند. با استفاده از روش های مستقیم، بی نظمی در توالی نوکلئوتیدی اولیه DNA (جهش ها و انواع آنها) شناسایی می شود. روش های مستقیم با دقت نزدیک به 100٪ مشخص می شوند.

اما در عمل می توان از این روش ها در شرایط خاصی استفاده کرد:

· با محلی سازی سیتوژنتیک شناخته شده ژن مسئول ایجاد یک بیماری ارثی.

· ژن بیماری باید شبیه سازی شود و توالی نوکلئوتیدی آن شناخته شود.

هدف از تشخیص مستقیم DNA شناسایی آلل های جهش یافته است.

بنابراین، در شرایطی که مشخص است چه نوع آسیب DNA منجر به یک بیماری ارثی می شود، قطعه DNA حاوی آسیب مستقیماً بررسی می شود، یعنی از روش تشخیص مستقیم DNA استفاده می شود.

با این حال، تا به امروز، ژن های بسیاری از بیماری ها نقشه برداری نشده اند، سازمان اگزون-اینترون آنها ناشناخته است، و بسیاری از بیماری های ارثی با ناهمگنی ژنتیکی مشخص مشخص می شوند، که اجازه استفاده کامل از روش های تشخیص مستقیم DNA را نمی دهد. بنابراین در مواردی که محل آسیب نامشخص است، از رویکرد دیگری که مربوط به مطالعه مجاورت ژن مسئول بیماری ژنی است، همراه با تجزیه و تحلیل خانوادگی، یعنی روش های غیرمستقیم تشخیص ژنتیکی مولکولی استفاده می شود. بیماری های ارثی استفاده می شود.

روش‌های مختلفی را می‌توان برای تشخیص جهش‌های نقطه‌ای و حذف‌های کوچک مورد استفاده قرار داد، اما همه آنها متکی به روش PCR هستند. این واکنش به شما امکان می دهد توالی نوکلئوتیدی DNA را چندین بار ضرب کنید و سپس به دنبال جهش بگردید. روش های جستجو برای قطعات DNA حامل جهش بر اساس تجزیه و تحلیل مقایسه ای توالی های نوکلئوتیدی DNA جهش یافته و طبیعی است.

تجزیه و تحلیل محصولات PCR

در فرآیند تشخیص مستقیم DNA

شامل مطالعه ویژگی های خاص ناحیه ژنی تقویت شده است. بنابراین، در بیماری های ناشی از گسترش تکرارهای تری نوکلئوتیدی، محصولات تقویتی از نظر طول (منعکس کننده تعداد متفاوت سه قلوها در ناحیه ژن مورد مطالعه) و در نتیجه سرعت حرکت آنها در ژل متفاوت است. به لطف این، یک جداسازی الکتروفورتیک واضح از آلل های طبیعی و جهش یافته و تعیین دقیق یک قطعه پاتولوژیک دراز به دست می آید، یعنی تشخیص DNA بیماری (شکل 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

برنج. 14. تشخیص حذف دهان بستن در ژن DYT 1 در بیماران مبتلا به دیستونی مستقل از دوپا (الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید). خطوط 2،3،6 - بیمار؛ آهنگ 1،4،5 - کنترل. فلش نازک آلل طبیعی را نشان می دهد، فلش ضخیم نشان دهنده آلل کوتاه تر جهش یافته است (حذف سه نوکلئوتید).

اگر کل ناحیه DNA مورد مطالعه بخشی از یک حذف گسترده باشد، به دلیل عدم وجود مکان برای هیبریداسیون پرایمر، تکثیر PCR DNA از این آلل حذف شده انجام نخواهد شد. در این مورد، حذف هموزیگوت بر اساس عدم وجود کامل محصول واکنش PCR تشخیص داده می شود (سنتز DNA از هر دو نسخه از ژن غیرممکن است). با حذف هتروزیگوت، می توان یک محصول PCR سنتز شده از یک آلل طبیعی (حفظ شده) را تشخیص داد، اما برای تشخیص مطمئن چنین جهشی، لازم است از روش های تصویربرداری DNA پیچیده تر استفاده شود که امکان تخمین دوز نهایی PCR را فراهم می کند. تولید - محصول.

برای شناسایی جهش‌های نقطه‌ای (اغلب تعویض‌های نوکلئوتیدی) در مکان‌های خاص، از روش PCR در ترکیب با سایر روش‌های آنالیز ژنتیکی مولکولی استفاده می‌شود. اگر مکان و ماهیت جهش نقطه فرضی دقیقاً شناخته شده باشد، آنگاه اندونوکلئازهای محدود کننده (آنزیم های محدود کننده) آنزیم های سلولی خاصی هستند که از سویه های مختلف باکتری جدا شده اند.

این آنزیم‌ها توالی‌های نوکلئوتیدی خاصی را که از چهار تا ده نوکلئوتید طول دارند، تشخیص می‌دهند. پس از آن، محدود کردن این توالی ها به عنوان بخشی از یک مولکول DNA دو رشته ای انجام می شود. سایت محدودیت (سایت شناسایی).

در مواردی که یک جهش نقطه‌ای، محل تشخیص طبیعی آنزیم محدودکننده خاص را تغییر می‌دهد، این آنزیم نمی‌تواند قطعه جهش یافته با PCR را شکافت. در برخی موارد، یک جهش منجر به ظهور یک مکان شناسایی جدید برای یک آنزیم محدود کننده خاص می شود که به طور معمول وجود ندارد.

در هر دو موقعیت، محصولات PCR جهش یافته و نرمال که با آنزیم محدودکننده انتخاب شده درمان می شوند، قطعات محدودکننده با طول های مختلف تولید می کنند که به راحتی با الکتروفورز قابل تشخیص هستند (شکل 15).

بنابراین، اگر تشخیص سریع هر جهش نقطه‌ای ضروری باشد، کار به جستجوی آنزیم محدودکننده مربوطه کاهش می‌یابد که محل تشخیص آن در محل توالی نوکلئوتیدی مختل شده است. درمان محصولات PCR با چنین آنزیمی محدود کننده، تمایز آسان آلل های نرمال و جهش یافته را ممکن می سازد. تجزیه و تحلیل محدودیت تا حد زیادی تشخیص جهش های نقطه ای شناخته شده را ساده می کند و اکنون به طور گسترده برای تشخیص مستقیم DNA بیماری های ارثی استفاده می شود.

مرحله نهایی تجزیه و تحلیل ژنتیکی مولکولی جهش هاتعیین توالی نوکلئوتیدی قطعه DNA مورد مطالعه (توالی یابی) است که با هنجار مقایسه شده و تشخیص ژنتیکی نهایی فرموله می شود. به لطف موفقیت های ژنتیک مولکولی، روش های تشخیص DNA برای بیش از 400 بیماری ارثی در حال حاضر توسعه یافته است.

برنج. 15. تشخیص جهش نقطه ای با استفاده از تحلیل محدودیت: A - ناحیه ژنی تقویت شده حاوی یک مکان محدودAGCTبرای اندونوکلئاز محدودآلو من. جهشجی→ آاین توالی نوکلئوتیدی را تغییر می دهد و در نتیجه آنزیم محدود کننده ایجاد می شودAluIمسدود؛ ب - الکتروفروگرام محصولات محدود کننده: مسیر 1 - هموزیگوسیتی برای آلل طبیعی. مسیر 2 - هموزیگوسیتی برای جهش. مسیر 3 - حالت هتروزیگوت (الل طبیعی + جهش).

تشخیص بیماری های ارثی بر اساس مطالعه مستقیم آلل های جهش یافته در بیماران، اعضای خانواده آنها یا ناقلان هتروزیگوت مشکوک جهش های پاتولوژیک، برای تشخیص پیش علامتی و پیش از تولد مناسب است که حداکثر می توان از آن استفاده کرد. مراحل اولیهرشد جنین، قبل از ظهور علائم بالینی یا بیوشیمیایی بیماری.

صرف نظر از روش تشخیص جهش، مشخصات مولکولی دقیق هر جهش تنها با توالی یابی مستقیم قابل دستیابی است. برای خودکار کردن این فرآیند در سال های گذشتهدستگاه های ویژه به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرند - ترتیب دهنده ها، که سرعت خواندن اطلاعات DNA را به میزان قابل توجهی امکان پذیر می کند.

مسیر استفاده گسترده‌تر از تحقیقات بیولوژیکی مولکولی در آزمایشگاه‌های تشخیصی بالینی با تسریع فرآیند تحلیلی با انجام تمام مراحل در یک زنجیره، بدون انتقال نمونه، ایجاد شرایطی برای جلوگیری از آلودگی در طول آزمایش موازی تعدادی از آنالیت‌ها و با ثبت عینی نتایج در هر چرخه

اصلاحات اصلی روش PCR

برای اسکن سریع و جستجوی جهش های ژنی شناخته شده استفاده می شود.

Multiplex (مولتی پرایمر) PCR

این روش مبتنی بر تکثیر همزمان چند اگزون از ژن مورد مطالعه در یک واکنش است. این امکان غربالگری سریع و مقرون به صرفه رایج ترین جهش ها را فراهم می کند. به عنوان مثال، برای تشخیص سریع ناقل حذف در ژن دیستروفین در بیماران مبتلا به دیستروفی عضلانی پیشرونده دوشن/بکر، تقویت همزمان مجموعه ای از اگزون های اغلب جهش یافته این ژن انجام می شود. از آنجایی که این بیماری ها به صورت مغلوب وابسته به X به ارث می رسند و با آسیب به تنها کروموزوم X در پسران همراه هستند، در صورت حذف طولانی مدت، الکتروفورز محصولات واکنش عدم وجود یک یا چند قطعه DNA (اگزون) را آشکار می کند. ) که می تواند به عنوان تایید مولکولی تشخیص باشد. علاوه بر این، با انتخاب بخش های ژنی خاص برای تکثیر PCR، ارزیابی نسبتاً دقیقی از طول کل حذف و نقاط شکست ژن (تا اگزون) امکان پذیر است.

استفاده ترکیبی از چندین واکنش مالتی پلکس، تشخیص تا 98 درصد از تمام حذف های رخ داده در بیماران مبتلا به دیستروفی عضلانی پیشرونده دوشن/بکر را ممکن می سازد. این تقریباً 60 درصد است تعداد کلجهش های شناخته شده در ژن دیستروفین و نشان دهنده کارایی بسیار بالای این روش غربالگری برای تشخیص DNA دیستروفینوپاتی ها است (شکل 16).

برنج. 16. تشخیص مستقیم DNA دیستروفی عضلانی دوشن با استفاده از Multiplex PCR (الکتروفورز ژل آگارز). در هر یک از افراد مورد بررسی، چهار اگزون از ژن دیستروفین به طور همزمان تکثیر شد (اگزون‌های 17، 19، 44 و 45؛ فلش‌ها محصولات تقویت مربوطه را نشان می‌دهند). خط 1 - کنترل، خطوط 2-5 - بیماران مبتلا به دیستروفی عضلانی دوشن با حذف های مختلف ژن دیستروفین (خط 2 و 5 - حذف اگزون 45، مسیر 3 - حذف اگزون 44، مسیر 4 - حذف اگزون های 17 و 19 ).

تقویت خاص آلل

این روش مبتنی بر استفاده از دو جفت پرایمر مستقل برای یک منطقه ژنی خاص است: یک آغازگر در هر دو جفت رایج است و پرایمر دوم در هر جفت ساختار متفاوتی دارد و مکمل یک توالی DNA طبیعی یا جهش یافته است. در نتیجه چنین واکنشی، دو نوع محصول PCR می توانند به طور همزمان در محلول سنتز شوند - نرمال و جهش یافته. علاوه بر این، طراحی پرایمرهای مورد استفاده، تمایز واضح محصولات تقویتی نرمال و جهش یافته را بر اساس اندازه مولکولی آنها ممکن می سازد. این روش بسیار بصری است و به شما این امکان را می دهد که هم حامل همو و هم هتروزیگوت آلل جهش یافته را تأیید کنید.

روشی برای اصلاح DNA تکثیر شده توسط سایت

این روش مبتنی بر استفاده از یک پرایمر به اصطلاح عدم تطابق در PCR (نه کاملا مکمل الگو) است که با توالی DNA الگو یک نوکلئوتید متفاوت است. در نتیجه گنجاندن پرایمر مشخص شده در محصول PCR جهش یافته، یک سایت محدود کننده مصنوعی برای یکی از اندونوکلئازهای محدود کننده در آن ایجاد می شود که امکان تشخیص مستقیم DNA یک جهش شناخته شده خاص را با استفاده از تجزیه و تحلیل محدودیت می دهد. ایجاد چنین سایت محدودیت مصنوعی در صورتی ضروری است که جستجو وجود یک آنزیم شناخته شده و در دسترس را نشان ندهد که محل محدودیت "طبیعی" آن در نتیجه ظاهر جهش مورد مطالعه در مولکول DNA تحت تأثیر قرار می گیرد. .

روش PCR ترانس کریپتاز معکوس (RT- PCR)

این روش در مواردی استفاده می‌شود که راحت‌تر از DNA ژنومی به عنوان هدف مطالعه استفاده شود، بلکه از cDNA فشرده‌تر و غنی‌تر از اطلاعات که پس از پردازش مناسب نمونه‌های بافتی به‌دست می‌آید، به عنوان مثال، مواد بیوپسی یا رده‌های سلولی لنفوسیت‌ها، استفاده می‌شود. فیبروبلاست ها و غیره. شرایط مهم در اینجا بیان (حداقل حداقل) ژن مورد نظر در بافت مورد مطالعه است.

در مرحله اول، رونویسی معکوس mRNA انجام می شود و مولکول های cDNA حاصل به عنوان یک الگو برای PCR عمل می کنند. متعاقباً، ناحیه بحرانی cDNA که به مقدار کافی تقویت شده است، در معرض توالی‌یابی و سایر روش‌های غربالگری جهشی، مطالعه الکتروفورتیک مستقیم (تشخیص حذف‌ها، درج‌ها و غیره) یا ادغام در یک سیستم بیانی قرار می‌گیرد تا به دست آید. محصول پروتئینیو تحلیل مستقیم آن

این روش به ویژه برای تشخیص جهش هایی که منجر به سنتز پروتئین "قطع" می شود (جهش های بی معنی، جهش های پیوندی، حذف های بزرگ) موثر است - به اصطلاح آنالیز PTT (تست برش پروتئین). تجزیه و تحلیل PTT معمولاً در مطالعه ژن‌های چند اگزون طولانی، مانند دیستروفی عضلانی دوشن/بکر، آتاکسی-تلانژکتازی یا نوروفیبروماتوز نوع 1 استفاده می‌شود.

Real-time PCR(Real-Time PCR، انگلیسی)

هر سال، PCR بلادرنگ به یک روش تشخیصی رایج در مراقبت های بهداشتی عملی تبدیل می شود. ویژگی اساسی آن نظارت و تجزیه و تحلیل کمی از تجمع محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز و ثبت خودکار و تفسیر نتایج به دست آمده است. این روش نیازی به مرحله الکتروفورز ندارد که باعث کاهش نیاز به آزمایشگاه PCR می شود. به دلیل صرفه جویی در فضای تولید، کاهش تعداد پرسنل و تقاضا برای تعیین کمی DNA/RNA، این روش در سال های اخیر با موفقیت در بزرگترین مراکز بهداشتی-اپیدمیولوژیک، تشخیصی و تحقیقاتی کشورهای پیشرفته جهان مورد استفاده قرار گرفته است. PCR در قالب فعلی ("کلاسیک") آن.

PCR بلادرنگ از پروب های الیگونوکلئوتیدی نشاندار شده با فلورسنت برای تشخیص DNA در حین تکثیر استفاده می کند. Real-time PCR امکان تجزیه و تحلیل کامل یک نمونه را در عرض 20-60 دقیقه فراهم می کند و از نظر تئوری قادر به تشخیص حتی یک مولکول DNA یا RNA در یک نمونه است.

برنج. 17. زمان واقعی PCR.

Real-time PCR از یک سیستم TaqMan استفاده می کند که سینتیک PCR را مستقیماً در طول تقویت با استفاده از خاموش کردن فلورسانس رزونانس کنترل می کند. برای تشخیص، از پروبی استفاده می شود که حاوی فلوروفور و کوئنچر مکمل قسمت میانی قطعه تقویت شده است. هنگامی که فلوروفور و خاموش کننده به پروب الیگونوکلئوتیدی متصل می شوند، فقط انتشار فلورسنت جزئی مشاهده می شود. در طول فرآیند تقویت، به دلیل فعالیت اگزونوکلئاز 5 اینچی Taq پلیمراز، برچسب فلورسنت به محلول می رود، از مجاورت خود به خاموش کننده رها می شود و سیگنال فلورسنتی تولید می کند که در زمان واقعی متناسب با تجمع تقویت کننده افزایش می یابد. شکل 17).

مزایای اصلی Real-Time PCR نسبت به PCR با الکتروفورز ژل:

· کل روش در یک لوله آزمایش انجام می شود.

· روش 1 ساعت طول می کشد.

· 1-2 اتاق کار کافی است.

· همراه با ارزیابی کیفیاندازه گیری نتیجه ممکن می شود (به عنوان مثال، هنگام تجویز درمان ضد ویروسی برای ایدز یا هپاتیت ویروسی، لازم است بار ویروسی، یعنی مقدار ویروس در واحد، که توسط PCR زمان واقعی ارائه می شود، بدانید).

· خطر آلودگی به شدت کاهش می یابد.

نتیجه

روش PCR یکی از رایج ترین روش های تحقیقات بیولوژیکی مولکولی است. این روش باید به صورت هوشمند توسط پزشکان استفاده شود و پزشکی که تصمیم به استفاده از PCR در کار خود دارد، باید اطلاعات خاصی در مورد ویژگی ها و قابلیت های این روش داشته باشد. ثانیا، باید بازخورد نزدیک بین پزشک و آزمایشگاه PCR وجود داشته باشد، که برای تجزیه و تحلیل موارد پیچیده و توسعه استراتژی تشخیصی صحیح ضروری است. ثالثاً، آنالیز PCR در تشخیص (عمدتاً بیماری‌های عفونی) نوشدارویی نیست و جایگزین روش‌های تحقیقاتی موجود نمی‌شود، بلکه تنها آنها را تکمیل می‌کند. و مهمتر از همه، PCR نمی تواند جایگزین شهود و تفکر تحلیلی شود که پزشکی که انتظار موفقیت دارد باید داشته باشد.

پ . اس . تحقیقات بیولوژیکی مولکولی - تغییر دستورالعمل برای تشخیص و درمان استفاده از روش های بیولوژیکی مولکولی با چشم انداز تغییر اساسی در تاکید در تشخیص آزمایشگاهی همراه است. ممکن است این فقط مربوط به اطلاعات به موقع نباشد، بلکه در مورد دریافت از قبل آن باشد. اگر اکنون آزمایشات آزمایشگاهی در اکثر موارد قبلاً زمانی که بیماری توسعه یافته و درمان شروع شده است انجام می شود، انتظار می رود اطلاعات آزمایشگاهی بیولوژیکی مولکولی امکان شناسایی تمایل فرد به انواع خاصی از آسیب شناسی و میزان حساسیت به داروهای خاص را فراهم کند. ، که ماهیت پزشکی آینده را پیش بینی کننده، پیشگیرانه و شخصی سازی می کند.

تغییر جهت تشخیص و درمان

بیماری های ارثی

امروز در آینده

تشخیص گذرنامه ژنتیکی

8. برای راه اندازی آزمایشگاه PCR با تشخیص فلورسنت (تجزیه و تحلیل کمی، Real-Time PCR) به چند اتاق کار نیاز است؟

9. تشخیص چیست؟

10. چه روش هایی برای تشخیص DNA وجود دارد؟

11. کار کدام آنزیم زمینه ساز PCR است؟

12. چرا باید منطقه تشخیص از سایر مناطق کاری حذف شود؟

13. سایت محدودیت چیست؟

14. روش های تشخیصی DNA مستقیم و غیر مستقیم چه تفاوت هایی با هم دارند؟

15. توالی یابی چیست؟

16. Multiplex PCR چیست؟

17. چه نوع جهش هایی با استفاده از PCR تعیین می شود؟

18. آلودگی چیست؟

19. ماهیت روش تقویت آلل خاص چیست؟

20. شرایط نگهداری مواد PCR؟

21. تقویت در چه دستگاهی صورت می گیرد؟

22. روش PCR ترانس کریپتاز معکوس (RT-PCR) چیست؟

23. چه چیزی به عنوان ماده برای تشخیص PCR عمل می کند؟

24. انواع آلودگی را نام ببرید؟

تست هایی برای خودآمادگی

1. آنزیم های محدود کننده اندونوکلئاز:

الف) آنزیم هایی که DNA را در مکان های کاملاً خاص "شکستن" می کنند.

ب) آنزیم هایی که به هم می چسبند در مولکول DNA شکسته می شوند.

ج) آنزیم هایی که ترکیباتی را فراهم می کنند که ترمیم DNA را انجام می دهند.

2. تقویت ژن:

3. کدام روش ژنتیک مولکولی برای تشخیص بیماری های ناشی از یک ژن جهش یافته از یک توالی شناخته شده استفاده می شود؟

الف) استفاده از یک آنزیم محدود کننده خاص؛

ب) تشخیص مستقیم با استفاده از پروب های مولکولی خاص.

ج) تجزیه و تحلیل خانواده توزیع پلی مورفیسم طول قطعه محدود طبیعی.

4. تعیین توالی DNA:

الف) شناسایی توالی پایه DNA؛

ب) تکرارهای متعدد هر بخش DNA.

ج) جداسازی قطعه DNA حاوی ژن مورد مطالعه.

5. برای به دست آوردن نمونه های DNA می توانید استفاده کنید :

ب) پرزهای کوریونی؛

ج) مایع آمنیوتیک؛

د) سلول های مایع آمنیوتیک؛

ه) نمونه برداری از پوست، ماهیچه ها، کبد،

ه) همه چیز درست است به جز نقطه "ج"،

ز) همه چیز درست است به جز نقطه "د"،

ح) همه موارد فوق درست است.

6. برای تشخیص اینکه کدام جهش ها از روش PCR استفاده می شود:

الف) ژنومی؛

ب) کروموزومی؛

ج) ژن (نقطه).

7. پرایمر این است:

الف) بخش مکمل DNA؛

ب) یک الیگونوکلئوتید مصنوعی نشاندار شده (به صورت رادیواکتیو یا فلورسنت) مکمل یک ژن جهش یافته یا طبیعی.

ج) یک الیگونوکلئوتید که به عنوان یک "پرایمر" عمل می کند و سنتز یک زنجیره پلی نوکلئوتیدی را بر روی یک ماتریس DNA یا RNA آغاز می کند.

8. چه کسی اصل روش PCR را توسعه داده است؟

ب) K. Mullis

9. آیا از روش PCR برای تشخیص انبساط تکرارهای تری نوکلئوتیدی (نوع پویای جهش) استفاده می شود؟

10. PCR در چه مناطقی استفاده می شود؟

الف) پزشکی بالینی؛

ب) تعیین موجودات تراریخته (GMOs)

ج) شناسنامه شخصی، استقرار پدری، پزشکی قانونی

د) تمام موارد فوق،

ه) هیچ یک از موارد فوق..

نمونه پاسخ: 1 - الف 2 - ب 3 - ب 4 - الف 5 – e; 6 – در 7 – در 8 - ب. 9 - a، 10 - g.

اصلی

1. ژنتیک بوچکوف. مسکو GEOTAR، 2002.

اضافی

1. باخارف و درمان بیماریهای مادرزادی و ارثی در کودکان. - مسکو، 2004.

2. تشخیص DNA و مشاوره ژنتیک پزشکی. - مسکو، 2004.

3. ژنتیک زنجبیل. - مسکو، 2003.

4. اصول ژنتیک پزشکی گوربونوف. – سن پترزبورگ: اینترمدیکا، 1999.

5. جی مک گی. تشخیص بالینی مولکولی - جهان، 1999.

6. Menshikov - تحقیقات بیولوژیکی در تشخیص آزمایشگاهی بالینی: احتمالات مشکل (سخنرانی). بالینی تشخیص آزمایشگاهی, № 3, 2006.

7. کار کورنینکو در آزمایشگاه PCR در طول تجزیه و تحلیل درون خطی مواد بیولوژیکی. تشخیص آزمایشگاهی بالینی، شماره 10، 1385.

8. سازماندهی کار آزمایشگاه PCR. دستورالعمل های روشی MU 1.3.1794-03. دکتر ارشد بهداشتی فدراسیون روسیه، 2003.

9. تکنولوژی Erlich H. A. PCR. – پرسین-المر سیتوس، 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real Time Quantitative PCR. ژنوم Res. – شماره 6، 1996.

اصول اساسی روش

واکنش زنجیره ای پلیمراز

راهنمای روش کار فوق برنامه دانش آموزان 3-4 ساله در تخصص های پزشکی عمومی (060101) و اطفال (060103).

GOU VPO "آکادمی پزشکی دولتی کراسنویارسک آژانس فدرال برای سلامت و توسعه اجتماعی"

روسیه، کراسنویارسک،

واکنش زنجیره ای پلیمراز 30 سال است که شناخته شده است. به طور گسترده در بسیاری از زمینه ها، از باستان شناسی گرفته تا ژنتیک استفاده می شود.

این روش PCR است که به ایجاد پدری کمک می کند، اما اغلب برای شناسایی بیماری های عفونی مختلف در بدن انسان استفاده می شود.

آنالیز PCR چگونه انجام می شود و چیست؟ ما سعی خواهیم کرد به این سوالات به تفصیل پاسخ دهیم.

تجزیه و تحلیل PCR - چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک روش تشخیصی ژنتیکی مولکولی با دقت بالا است که به شما امکان می دهد بیماری های عفونی و ارثی مختلف را در انسان، چه در مراحل حاد و چه در مراحل مزمن، و مدت ها قبل از اینکه بیماری خود را نشان دهد، شناسایی کنید.

روش PCR کاملا اختصاصی است و اگر به درستی انجام شود نمی تواند نتیجه مثبت کاذب بدهد. یعنی اگر عفونت وجود نداشته باشد، تجزیه و تحلیل هرگز وجود آن را نشان نخواهد داد. بنابراین، در حال حاضر اغلب، برای تأیید تشخیص، آزمایش PCR را برای تعیین پاتوژن و ماهیت آن انجام می دهند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) توسط کاری مولیس (ایالات متحده آمریکا) در سال 1983 ساخته شد و به همین دلیل در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد.

مزیت این روش چیست؟

تشخیص با این روش به شما امکان می دهد پاتوژن را مستقیماً در ژنی که در مواد مورد مطالعه موجود است پیدا کنید. این دقیق ترین آزمایش برای عفونت های مقاربتی است، عفونت های پنهان، انواع بیماری های مقاربتی.

تفاوت بین تشخیص PCR و سایر روش های تحقیقات آزمایشگاهیبه شرح زیر است:

• هدف این روش شناسایی خود پاتوژن است.
• تشخیص با استفاده از روش PCR با تطبیق پذیری آن متمایز می شود: برای تشخیص چندین پاتوژن.
• بیماری ها، فقط یک نمونه بیولوژیکی از بیمار کافی است.
• این روش بسیار حساس است و با سایر واکنش های متقاطع همراه نیست.

علاوه بر این، مزیت تشخیص PCR این است که هر ماده بیولوژیکی بیمار برای تجزیه و تحلیل مناسب است: خون، ترشحات تناسلی، ادرار، مایع منی.

اسمیر PCR چه عفونت هایی را می تواند تشخیص دهد؟

بدن ممکن است حاوی تعداد زیادی ازعوامل عفونی، این شامل عوامل "پنهان" نیز می شود که برای مدت طولانی خود را نشان نمی دهند.

تجزیه و تحلیل اسمیر PCR به شما امکان می دهد چنین عفونت هایی را تشخیص دهید:

• اوره پلاسموز اندام های تناسلی؛
• کاندیدیازیس();
• تبخال؛
• وجود سلول های سرطانی؛
• ارزیابی وضعیت هورمونی؛

ماده آزمایش PCR معمولاً خلط، بزاق، ادرار و خون است. قبل از انجام تجزیه و تحلیل، ابتدا باید با مشورت با پزشک، به دقت برای آن آماده شوید.

خون برای PCR معمولاً با معده خالی اهدا می شود. نتایج خوبزمانی که مواد برای تحقیق از کانال دهانه رحم یا مجرای ادرار گرفته می شود، تجزیه و تحلیل را نشان می دهد. در این مورد، بهتر است تشخیص PCR حداکثر یک روز پس از رابطه جنسی انجام شود.

انواع PCR

PCR در بسیاری از زمینه ها برای آزمایش و آزمایش های علمی استفاده می شود. روش های مختلفی برای تجزیه و تحلیل وجود دارد:

1. رونویسی معکوس PCR(Reverse Transcription PCR، RT-PCR) - برای تقویت، جداسازی یا شناسایی یک توالی شناخته شده از یک کتابخانه RNA استفاده می شود.
2. PCR معکوس(PCR معکوس) - زمانی استفاده می شود که فقط یک ناحیه کوچک در توالی مورد نظر شناخته شده باشد. این روش به ویژه هنگامی که به تعیین توالی های همسایه پس از درج DNA در ژنوم می رسد مفید است.
3. Nested PCR برای کاهش تعداد محصولات جانبی واکنش استفاده می شود. دو جفت پرایمر استفاده می شود و دو واکنش متوالی انجام می شود.
4. PCR نامتقارن(eng. Asymmetric PCR) - زمانی انجام می شود که لازم باشد عمدتاً یکی از رشته های DNA اصلی تقویت شود. در برخی از تکنیک های تجزیه و تحلیل توالی و هیبریداسیون استفاده می شود.
5. PCR کمی(Quantitative PCR، Q-PCR (انگلیسی)) یا Real-time PCR - برای نظارت مستقیم بر اندازه گیری مقدار یک محصول خاص PCR در هر چرخه واکنش استفاده می شود.
6. گام به گام PCR (Touchdown PCR) - با استفاده از این رویکرد، تأثیر اتصال پرایمر غیر اختصاصی کاهش می یابد.
7. PCR مخصوص گروه(eng. group-specific PCR) - PCR برای توالی های مرتبط در یک گونه یا بین گونه های مختلف، با استفاده از آغازگرهای محافظه کار برای این توالی ها.

اگر توالی نوکلئوتیدی الگو تا حدی شناخته شده یا اصلاً ناشناخته باشد، می توان از آغازگرهای دژنره شده استفاده کرد که توالی آن ها دارای موقعیت های انحطاطی است که هر پایه ای می تواند در آن قرار گیرد. به عنوان مثال، دنباله آغازگر می تواند: ...ATH...، که در آن H A، T یا C است.

چه مواد بیولوژیکی در حال مطالعه هستند؟

رسانه های بیولوژیکی مختلف و مایعات انسانی می توانند به عنوان موادی برای تحقیقات PCR استفاده شوند، که در آن DNA باکتری خارجی یا DNA یا RNA ویروسی را می توان تشخیص داد:

1. ادرار می تواند برای عفونت های دستگاه تناسلی در مردان و اندام های ادراری در زنان استفاده شود (در مردان استفاده از ادرار به عنوان ماده جایگزین خراشیدن اپیتلیال می شود).
2. خلط. برای تشخیص سل و کمتر رایج برای تشخیص اشکال تنفسی کلامیدیا و مایکوپلاسموز استفاده می شود. خلط به مقدار 15-20 میلی لیتر در یک بطری استریل (یکبار مصرف) جمع آوری می شود.
3. مایعات بیولوژیکی. آب پروستات، پلور، نخاع، مایع آمنیوتیک، مایع مفصلی، شستشوی برونش آلوئولار، بزاق بر اساس نشانه ها جمع آوری می شود.
4. خراشیدن اپیتلیال از غشاهای مخاطی. معمولاً برای تشخیص بیماری های مقاربتی (STDs) مانند سوزاک، کلامیدیا، مایکوپلاسموز، اوره پلاسموز، تریکومونیاز، گاردنرلوز، تبخال و سایر عفونت هایی که بر غشاهای مخاطی تأثیر می گذارند استفاده می شود.
5. بیوپسی ها متداول ترین بیوپسی های معده هستند دوازدههبرای تشخیص عفونت هلیکوباکتر پیلوری
6. خون، پلاسما، سرم. برای تجزیه و تحلیل PCR هپاتیت B، C، D، G، تبخال، CMV، ویروس های HIV و تحقیقات ژن های انسانی استفاده می شود.

چگونه برای آزمون آماده شویم؟

قابلیت اطمینان نتیجه PCR مستقیماً به ارسال صحیح مواد برای بررسی بستگی دارد. مطالب نباید آلوده باشد، در غیر این صورت نتیجه مطالعه عینی نخواهد بود. مهم ترین توصیه ها قبل از انجام آزمایش PCR شامل موارد زیر است:

1. ادرار در صبح در یک ظرف استریل جمع آوری می شود.
2. آزمایش خون برای عفونت باید صبح ناشتا انجام شود.
3. روز قبل از آزمایش نباید از نظر جنسی فعال باشید.

نتیجه آنالیز 1.5-2 روز پس از عمل مورد نظر آماده خواهد شد. شرایطی وجود دارد که می توان نتیجه را در همان روز تهیه کرد.

رمزگشایی تجزیه و تحلیل OPC

فرآیند تفسیر تحقیق ارائه شده به دلیل سادگی آن متمایز است. نتایج آنالیز PCR را می توان 1.5-2 روز پس از ارسال مطالب به دست آورد. در برخی موارد، نتیجه در روز اول آماده است، و در اینجا معنی آنها می تواند باشد:

• نتیجه منفینشان می دهد که مواد تشخیصی حاوی عامل عفونی مورد نظر نیست.
• PCR مثبتبه این معنی که DNA یا RNA پاتوژن در بدن انسان وجود دارد.

در برخی موارد، میکروارگانیسم ها کمیت می شوند. این امر به ویژه در مورد بیماری های ناشی از میکروارگانیسم های فرصت طلب صادق است. از آنجایی که این باکتری ها اثرات منفی خود را فقط در مقادیر زیاد از خود نشان می دهند.

همچنین، تجزیه و تحلیل کمی PCR برای انتخاب تاکتیک های درمانی و به منظور نظارت بر درمان چنین مواردی مهم است. عفونت های ویروسیمانند ویروس HIV و هپاتیت.

تشخیص PCR عفونت ها چقدر دقیق است؟

روش PCR با دقت، ویژگی و حساسیت بالا مشخص می شود. این به آن معنا است این تحلیلقادر به:

• وجود یا عدم وجود عفونت را به دقت تعیین کنید.
• دقیقاً نوع عفونت را مشخص کنید (ویژگی).
• تشخیص عفونت حتی با محتوای بسیار کم DNA میکروبی در مواد بیولوژیکی،
• که تست شد (حساسیت).

تجزیه و تحلیل PCR: قیمت و زمان

قیمت یک آزمایش خاص به عفونتی که برای آن آزمایش خواهید شد بستگی دارد. قیمت ها و شرایط تقریبی:

1. STI: 300-500 روبل، شرایط - 1 روز؛
2. ویروس اپشتین بار، ویروس پاپیلومای انسانی، تبخال، سیتومگالوویروس: 300-500 روبل، شرایط - 1 روز؛
3. هپاتیت A، B، C، D، G: تجزیه و تحلیل کیفی 650 روبل، تجزیه و تحلیل کمی 2000 روبل. شرایط - حداکثر 5 روز؛
4. آنتی بادی علیه ویروس هپاتیت C، کل (Anti-HCV) - 420 روبل.
5. آنتی بادی علیه ویروس هپاتیت C، IgM (Anti-HCV IgM) - 420 روبل.
6. هلیکوباکتر پیلوری: 300-400 روبل، شرایط - 1 روز؛
7. HIV (آنتی بادی ها و آنتی ژن ها) - 380 روبل.
8. HIV RNA با کیفیت بالا - 3500 روبل.
9. HIV RNA، از نظر کمی - 11000 روبل.

برای صرفه جویی در هزینه، می توانید یک بسته تحلیل ثابت را انتخاب کنید. این خدمات توسط اکثر کلینیک ها ارائه می شود که در آنها می توانید با استفاده از روش PRC (اینویترو، کلینیک و غیره) آزمایش دهید.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR، PCR - واکنش زنجیره ای پلیمراز) روشی برای به دست آوردن کپی های متعدد از قطعات (ژن ها) DNA خاص در یک نمونه بیولوژیکی است.

ماهیت PCR به عنوان یک روش زیست شناسی مولکولی، کپی برداری انتخابی مکرر از یک ژن خاص (بخشی از DNA) با استفاده از آنزیم های خاص تحت شرایط است. درونکشتگاهی. یکی از ویژگی های مهم PCR تولید نسخه هایی از یک بخش DNA (ژن) خاص است که شرایط مشخصی را برآورده می کند. مترادف فرآیند کپی کردن DNA "تقویت" است. همانندسازی DNA in vivoرا نیز می توان تقویت در نظر گرفت. با این حال، برخلاف همانندسازی، فرآیند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بخش‌های کوتاه DNA (حداکثر 40000 جفت باز) را تقویت می‌کند.

اصول اساسی

بنابراین، PCR کپی کردن مکرر قطعات DNA خاص در شرایط آزمایشگاهی در طول چرخه های دمایی مکرر است. چگونه فرآیند واکنش در یک چرخه دمایی رخ می دهد؟

تشکیل زنجیره نوکلئوتیدی توسط آنزیم DNA پلیمراز انجام می شود. با این حال، برای شروع کار، آنزیم نیاز به یک سکوی پرتاب دارد. پلتفرم ها "پرایمر" (بذر) هستند - الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی به طول 15-20 نوکلئوتید. باید دو آغازگر وجود داشته باشد (جلو و معکوس)، آنها مکمل بخش هایی از الگوی DNA هستند، و این قطعه DNA محدود شده توسط پرایمرها است که بارها توسط DNA پلیمراز کپی می شود. کار پلیمراز اضافه کردن متوالی نوکلئوتیدهای مکمل به توالی الگوی DNA است. بنابراین، در یک چرخه دمایی، دو قطعه DNA جدید دوباره سنتز می شوند (از آنجایی که مولکول DNA دو رشته ای است، در ابتدا دو ماتریس وجود دارد). بنابراین، طی 25-35 چرخه، میلیاردها نسخه از ناحیه DNA تعیین شده توسط پرایمرها در لوله آزمایش تجمع می یابد. ساختار یک چرخه جداگانه را می توان به صورت زیر نشان داد:

1. دناتوره شدن DNA (ذوب شدن، واگرایی زنجیره های DNA) - 95 درجه سانتیگراد - 1 یا 2 دقیقه.
2. بازپخت پرایمرها (پرایمرها به الگوی DNA متصل می شوند، دمای این مرحله با ترکیب نوکلئوتیدی پرایمر تعیین می شود) - 60 درجه سانتیگراد (به عنوان مثال) - 1 دقیقه.
3. افزایش طول DNA (پلی مراز یک زنجیره DNA را سنتز می کند) - 72 درجه سانتیگراد - 1 دقیقه (زمان به طول قطعه سنتز شده بستگی دارد).

ابزار دقیق برای استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز در آزمایشگاه باید شامل موارد زیر باشد:

1. (یا همانطور که به آن سیکلر حرارتی نیز گفته می شود)؛
2. سیستم های s (برای تجسم نتایج PCR)؛
3. سیستم ها (برای تجزیه و تحلیل نتایج PCR)؛
4. (برای تهیه نمونه)؛
5. مجموعه (مکانیکی یا الکترونیکی).

علاوه بر تجهیزات اصلی و کمکی برای عملکرد کامل آزمایشگاه PCR، برخی از مواد مصرفی مورد نیاز است: نوک استریل، لوله آزمایش، قفسه برای لوله های آزمایش و توزیع کننده ها.

پایه معرف در یک آزمایشگاه PCR معمولی برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز کامل شامل آنزیم DNA پلیمراز با بافر، پرایمرها (قطعات DNA مصنوعی کوچک مکمل ابتدا و انتهای بخش تجزیه و تحلیل شده الگوی DNA)، مخلوطی از نوکلئوتیدها (A، T، G، C). آب تصفیه شده نیز کاملا ضروری است.

مزایای روش PCR

حساسیت بالای مطالعه

حساسیت روش به حدی است که می توان با PCR تکثیر و توالی هدف را شناسایی کرد حتی اگر یک بار در نمونه 105 سلولی رخ دهد.

ویژگی سنجش

PCR به شما امکان می دهد DNA یک عامل عفونی خاص را در حضور DNA سایر میکروارگانیسم ها و DNA ارگانیسم میزبان شناسایی کنید و همچنین ژنوتیپ را انجام دهید. با انتخاب اختصاصی اجزای واکنش (پرایمرها)، می توانید به طور همزمان DNA میکروارگانیسم های نزدیک به هم را شناسایی کنید.

تطبیق پذیری روش PCR

واقعیت این است که برای تشخیص PCR بیماری‌های عفونی یا بیماری‌های ارثی انسان، می‌توانید از تجهیزات مشابه استفاده کنید، از روش‌های جهانی برای آماده‌سازی و تجزیه و تحلیل نمونه و همچنین از همان نوع کیت‌های معرف پیروی کنید.

صرفه جویی در زمان

مزیت مهم PCR عدم وجود مراحل کار میکروبیولوژیکی فرهنگی است. آماده سازی نمونه، عملکرد واکنش و تجزیه و تحلیل نتایج ساده و تا حد زیادی خودکار است. با تشکر از این، زمان برای به دست آوردن نتایج را می توان به 4-5 ساعت کاهش داد.

کارایی روش PCR

وسعت مواد بالینی مورد مطالعه

نه تنها مواد بیولوژیکی از یک بیمار می تواند به عنوان نمونه در یک واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شود، بلکه بسیاری از سوبستراهای دیگر که در آنها مولکول های DNA را می توان با حساسیت بالا شناسایی کرد، به عنوان مثال، آب، خاک، غذا، میکروارگانیسم ها، سواب ها و موارد دیگر. .

تمام مزایای فوق این روش منحصر به فرد - حساسیت و ویژگی بالا، شناسایی عامل عفونی و تعیین ژنوتیپ هر ژن انسانی، راندمان بالا و صرفه جویی در زمان، تطبیق پذیری پایه ابزار - این امکان را به روش PCR می دهد که امروزه به طور گسترده در بالینی مورد استفاده قرار گیرد. تشخیص، عمل پزشکی, تحقیق علمی، کنترل کیفیت و بسیاری از زمینه های دیگر.

کاربرد PCR

زمینه های کاربرد واکنش زنجیره ای پلیمراز به عنوان یک روش مدرن زیست شناسی مولکولی متنوع است. این تا حد زیادی به دلیل گستردگی مواد قابل تجزیه و تحلیل است (تقریباً هر چیزی که بتوان از آن DNA کم و بیش باکیفیت جدا کرد می‌تواند به موضوع تحقیق تبدیل شود)، و همچنین آغازگرهای انتخاب شده. زمینه های اصلی کاربرد PCR:

پزشکی بالینی

• تشخیص بیماری های عفونی
• تشخیص بیماری های ارثی
• تشخیص جهش
• ژنوتیپ کردن
• فناوری های سلولی
• ایجاد گذرنامه ژنتیکی

بوم شناسی

• نظارت بر محیط زیست
• تجزیه و تحلیل مواد غذایی
• تجزیه و تحلیل ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی (GMOs)

پزشکی قانونی و جرم شناسی

• شناسایی شخصی
• استقرار پدری

فارماکولوژی

دامپزشکی

تحقیقات علمی (زیست شناسی مولکولی، ژنتیک)

سازماندهی آزمایشگاه PCR

ترتیب اطلاعات

نام	جلد	تولید	روش	گربه شماره

1. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

2. اصل روش واکنش زنجیره ای پلیمراز

2.1 وجود تعدادی از اجزاء در مخلوط واکنش

2.2 رژیم دمای چرخه ای

2.3 اصول اولیه برای انتخاب پرایمرها

2.4 اثر فلات

3. مراحل PCR

3.2 تقویت

3.4.1 کنترل های مثبت

3.4.2 کنترل های داخلی

4.1 تجزیه و تحلیل کیفی

4.1.2 تشخیص مولکول های RNA

3.1 تهیه نمونه بیولوژیکی

برای جداسازی DNA، بسته به وظایفی که انجام می شود، از تکنیک های مختلفی استفاده می شود. ماهیت آنها در استخراج (استخراج) DNA از یک آماده سازی بیولوژیکی و حذف یا خنثی سازی ناخالصی های خارجی برای به دست آوردن یک آماده سازی DNA با خلوص مناسب برای PCR است.

روش به دست آوردن یک آماده سازی DNA خالص توصیف شده توسط Marmur استاندارد در نظر گرفته می شود و قبلاً کلاسیک شده است. این شامل پروتئولیز آنزیمی و به دنبال آن پروتئین زدایی و رسوب مجدد DNA با الکل است. این روش به شما امکان می دهد یک آماده سازی DNA خالص را بدست آورید. با این حال، کاملاً کار فشرده است و شامل کار با چنین تهاجمی و بوی قویموادی مانند فنل و کلروفرم.

یکی از روش های رایج در حال حاضر، روش استخراج DNA است که توسط بوم و همکاران پیشنهاد شده است. این روش مبتنی بر استفاده از یک عامل آشوب‌گردان قوی، گوانیدین تیوسیانات (GuSCN)، برای لیز سلولی و جذب بعدی DNA بر روی یک حامل (دانه‌های شیشه‌ای، خاک دیاتومه، شیر شیشه‌ای و غیره) است. پس از شستشو، DNA در نمونه باقی می ماند و روی حامل جذب می شود و با استفاده از یک بافر شستشو به راحتی از آن جدا می شود. این روش مناسب، از نظر فناوری پیشرفته و مناسب برای تهیه نمونه برای تقویت است. با این حال، از دست دادن DNA به دلیل جذب غیرقابل برگشت در حامل و همچنین در طول شستشوهای متعدد امکان پذیر است. این امر به ویژه هنگام کار با مقادیر کمی از DNA در یک نمونه مهم است. علاوه بر این، حتی مقادیر کمی از GuSCN می تواند PCR را مهار کند. بنابراین، هنگام استفاده از این روش، انتخاب صحیح جاذب و رعایت دقیق نکات ظریف تکنولوژیکی بسیار مهم است.

گروه دیگری از روش‌های آماده‌سازی نمونه مبتنی بر استفاده از مبدل‌های یونی نوع Chilex است که برخلاف شیشه، DNA را جذب نمی‌کند، بلکه ناخالصی‌هایی است که در واکنش تداخل دارند. به عنوان یک قاعده، این فناوری شامل دو مرحله است: جوشاندن نمونه و جذب ناخالصی ها در مبدل یونی. این روش به دلیل سادگی اجرا بسیار جذاب است. در بیشتر موارد برای کار با مواد بالینی مناسب است. متأسفانه گاهی اوقات نمونه هایی با ناخالصی وجود دارد که با استفاده از مبدل های یونی قابل حذف نیستند. علاوه بر این، برخی از میکروارگانیسم ها را نمی توان با جوشاندن ساده از بین برد. در این موارد لازم است مراحل تکمیلی پردازش نمونه معرفی شود.

بنابراین، انتخاب روش آماده سازی نمونه باید با درک اهداف تجزیه و تحلیل مورد نظر انجام شود.

3.2 تقویت

برای انجام واکنش تقویت، لازم است مخلوط واکنش تهیه شود و نمونه DNA آنالیز شده به آن اضافه شود. مهم است که برخی از ویژگی های آنیل پرایمر را در نظر بگیرید. واقعیت این است که، به عنوان یک قاعده، نمونه بیولوژیکی تجزیه و تحلیل شده حاوی مولکول های مختلف DNA است که آغازگرهای مورد استفاده در واکنش دارای همسانی جزئی و در برخی موارد قابل توجه هستند. علاوه بر این، پرایمرها می توانند به یکدیگر بازپخت شوند و دایمرهای آغازگر را تشکیل دهند. هر دو منجر به مصرف قابل توجه پرایمرها برای سنتز محصولات جانبی (غیر اختصاصی) محصولات واکنش می شوند و در نتیجه حساسیت سیستم را به میزان قابل توجهی کاهش می دهند. این امر خواندن نتایج واکنش را در طول الکتروفورز دشوار یا غیرممکن می کند.

3.3 ارزیابی نتایج واکنش

برای ارزیابی صحیح نتایج PCR، درک آن مهم است این روشکمی نیست از نظر تئوری، محصولات تقویت مولکول های DNA هدف تک را می توان با استفاده از الکتروفورز پس از 30-35 چرخه شناسایی کرد. با این حال، در عمل، این فقط در مواردی انجام می شود که واکنش در شرایط نزدیک به ایده آل انجام می شود، که اغلب در زندگی چنین نیست. درجه خلوص آماده سازی DNA تأثیر زیادی بر کارایی تقویت دارد، به عنوان مثال. وجود بازدارنده های خاصی در مخلوط واکنش که در برخی موارد خلاص شدن از شر آنها بسیار دشوار است. گاهی اوقات، به دلیل وجود آنها، حتی ده ها هزار مولکول DNA هدف را نمی توان تقویت کرد. بنابراین، اغلب هیچ رابطه مستقیمی بین مقدار اولیه DNA هدف و مقدار نهایی محصولات تقویت وجود ندارد.

3.3.1 روش الکتروفورز افقی

روش های مختلفی برای تجسم نتایج تقویت استفاده می شود. رایج ترین روش امروزه الکتروفورز است که بر اساس جداسازی مولکول های DNA بر اساس اندازه است. برای انجام این کار، یک صفحه از ژل آگارز تهیه کنید که آگارز پس از ذوب در بافر الکتروفورز با غلظت 1.5-2.5٪ با افزودن یک رنگ خاص DNA، به عنوان مثال، اتیدیوم بروماید، جامد می شود. آگارز جامد شده یک شبکه فضایی را تشکیل می دهد. هنگام ریختن با استفاده از شانه، چاه های خاصی در ژل تشکیل می شود که متعاقباً محصولات تقویت کننده به آن اضافه می شود. صفحه ژل در یک دستگاه الکتروفورز ژل افقی قرار می گیرد و یک منبع ولتاژ ثابت متصل می شود. DNA با بار منفی شروع به حرکت در ژل از منفی به مثبت می کند. در این حالت، مولکول‌های DNA کوتاه‌تر سریع‌تر از مولکول‌های طولانی‌تر حرکت می‌کنند. سرعت حرکت DNA در ژل تحت تأثیر غلظت آگارز، قدرت میدان الکتریکی، دما، ترکیب بافر الکتروفورز و تا حدودی ترکیب GC DNA است. همه مولکول های یک اندازه با سرعت یکسان حرکت می کنند. رنگ توسط گروه های مسطح در مولکول های DNA ادغام می شود. پس از اتمام الکتروفورز که از 10 دقیقه تا 1 ساعت طول می کشد، ژل بر روی یک فیلتر ترانسیلومیناتور قرار می گیرد که نور در محدوده فرابنفش (254 - 310 نانومتر) ساطع می کند. انرژی فرابنفش جذب شده توسط DNA در 260 نانومتر به رنگ منتقل می شود و باعث فلورسانس آن در ناحیه نارنجی قرمز طیف مرئی (590 نانومتر) می شود.

روشنایی باندهای محصول تقویت کننده ممکن است متفاوت باشد. با این حال، این نمی تواند به مقدار اولیه DNA هدف در نمونه مرتبط باشد.

3.3.2 روش الکتروفورز عمودی

روش الکتروفورز عمودی اساساً مشابه الکتروفورز افقی است. تفاوت آنها در این است که در در این موردبه جای آگارز از ژل های پلی آکریل آمید استفاده می شود. این در یک محفظه مخصوص برای الکتروفورز عمودی انجام می شود. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید وضوح بیشتری در مقایسه با الکتروفورز آگارز دارد و به فرد اجازه می دهد تا مولکول های DNA با اندازه های مختلف را با دقت یک نوکلئوتید تشخیص دهد. تهیه ژل پلی آکریل آمید تا حدودی پیچیده تر از ژل آگارز است. علاوه بر این، آکریل آمید است ماده سمی. از آنجایی که نیاز به تعیین اندازه یک محصول تقویتی با دقت 1 نوکلئوتید به ندرت ایجاد می شود، روش الکتروفورز افقی در کارهای معمول استفاده می شود.

3.4 نظارت بر پیشرفت واکنش تقویت

3.4.1 کنترل های مثبت

آماده سازی DNA از میکروارگانیسم مورد نظر به عنوان یک "کنترل مثبت" استفاده می شود. آمپلیکون های غیر اختصاصی از نظر اندازه با آمپلیکون های تشکیل شده در نتیجه تقویت با آماده سازی DNA کنترل متفاوت است. محصولات غیر اختصاصی ممکن است در مقایسه با کنترل مثبت از نظر اندازه بزرگتر یا کوچکتر باشند. در بدترین حالت، این اندازه ها ممکن است منطبق باشند و در الکتروفورز مثبت خوانده شوند.

برای کنترل ویژگی محصول تقویت شده، می‌توانید از پروب‌های هیبریداسیون (بخش‌های DNA واقع در توالی تقویت‌شده)، برچسب‌گذاری شده با برچسب‌های آنزیمی یا ایزوتوپ‌های رادیواکتیو و برهمکنش با DNA مطابق با اصول اولیه پرایمرها استفاده کنید. این به طور قابل توجهی تجزیه و تحلیل را پیچیده و طولانی می کند و هزینه آن به طور قابل توجهی افزایش می یابد.

3.4.2 کنترل های داخلی

نظارت بر پیشرفت تقویت در هر لوله با مخلوط واکنش ضروری است. برای این منظور از کنترل اضافی به اصطلاح "کنترل داخلی" استفاده می شود. هر آماده سازی DNA است که با DNA میکروارگانیسم مورد نظر متفاوت است. اگر یک کنترل داخلی به مخلوط واکنش اضافه شود، همان هدف برای بازپخت پرایمر مانند DNA کروموزومی عامل عفونی مورد نظر خواهد بود. اندازه محصول تقویت کننده کنترل داخلی به گونه ای انتخاب می شود که 2 یا بیشتر از آمپلیکون های تشکیل شده از تکثیر DNA میکروارگانیسم مورد نظر بزرگتر باشد. در نتیجه، اگر DNA کنترل داخلی همراه با نمونه آزمایش به مخلوط واکنش اضافه شود، بدون در نظر گرفتن وجود یک میکروارگانیسم در نمونه بیولوژیکی، کنترل داخلی باعث تشکیل آمپلیکون های خاص، اما به طور قابل توجهی طولانی تر (سنگین تر) می شود. از آمپلیکون میکروارگانیسم. وجود آمپلیکون های سنگین در مخلوط واکنش نشان دهنده پیشرفت طبیعی واکنش تقویت و عدم وجود بازدارنده خواهد بود. اگر آمپلیکون هایی با اندازه مورد نیاز تشکیل نشده باشند، اما آمپلیکن های کنترل داخلی نیز تشکیل نشده باشند، می توان نتیجه گرفت که ناخالصی های نامطلوبی در نمونه آنالیز شده وجود دارد که باید حذف شوند، اما نه در مورد عدم وجود DNA مورد نظر.

متأسفانه علیرغم همه جذابیت های این رویکرد، نقص قابل توجهی دارد. اگر DNA مورد نظر در مخلوط واکنش وجود داشته باشد، به دلیل رقابت با کنترل داخلی برای آغازگرها، راندمان تقویت آن به شدت کاهش می یابد. این امر به ویژه در غلظت های پایین DNA در نمونه آزمایش مهم است که می تواند منجر به نتایج منفی کاذب شود.

با این حال، به شرطی که مشکل رقابت برای پرایمرها حل شود، مطمئناً این روش نظارت بر راندمان تقویت بسیار مفید خواهد بود.

4. روش های مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز

4.1 تجزیه و تحلیل کیفی

روش کلاسیک انجام PCR، که اصول آن در بالا ذکر شد، در برخی اصلاحات با هدف غلبه بر محدودیت‌های PCR و افزایش کارایی واکنش ایجاد شده است.

4.1.1 روش انجام PCR با استفاده از "شروع داغ"

برای کاهش خطر تشکیل محصولات واکنش تقویتی غیر اختصاصی، از رویکردی به نام «شروع داغ» استفاده می‌شود که ماهیت آن جلوگیری از شروع واکنش است تا زمانی که شرایطی در لوله آزمایش حاصل شود که بازپخت اختصاصی پرایمرها را تضمین کند.

واقعیت این است که بسته به ترکیب و اندازه GC، آغازگرها دمای ذوب مشخصی (Tm) دارند. اگر دمای سیستم از Tm بیشتر شود، پرایمر نمی تواند به رشته DNA بچسبد و دناتوره شود. مشروط به شرایط بهینه، یعنی. با دمای بازپخت نزدیک به دمای ذوب، پرایمر تنها در صورتی یک مولکول دو رشته ای را تشکیل می دهد که کاملا مکمل هم باشد و بنابراین ویژگی واکنش را تضمین می کند.

گزینه های مختلفی برای اجرای "شروع داغ" وجود دارد:

افزودن Taq پلیمراز به مخلوط واکنش در اولین چرخه پس از گرم کردن لوله تا دمای دناتوراسیون.

جداسازی مواد تشکیل دهنده مخلوط واکنش توسط یک لایه پارافین به لایه ها (در قسمت پایین - آغازگرها، در قسمت بالایی - Taq polymerase و اهداف DNA) که با ذوب شدن پارافین (~65-75 0 C) مخلوط می شوند.

استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال به Taq پلیمراز. آنزیم محدود شده توسط آنتی بادی های مونوکلونال تنها پس از اولین مرحله دناتوراسیون فعال می شود، زمانی که آنتی بادی های مونوکلونال به طور برگشت ناپذیر دناتوره شده و محل های فعال Taq پلیمراز را آزاد می کنند.

در تمام موارد فوق، حتی اگر بازپخت غیراختصاصی قبل از شروع چرخه دما رخ داده باشد، ازدیاد طول رخ نمی‌دهد و با گرم شدن، کمپلکس‌های پرایمر-DNA دناتوره می‌شوند، بنابراین محصولات غیر اختصاصی تشکیل نمی‌شوند. پس از آن، دما در لوله آزمایش کمتر از دمای ذوب نمی شود، که تشکیل یک محصول تقویت کننده خاص را تضمین می کند.

4.1.2 تشخیص مولکول های RNA

امکان استفاده از RNA به عنوان هدف برای PCR به طور قابل توجهی دامنه کاربردهای این روش را گسترش می دهد. به عنوان مثال، ژنوم بسیاری از ویروس ها (هپاتیت C، ویروس آنفولانزا، پیکورناویروس و غیره) با RNA نشان داده می شود. علاوه بر این، در چرخه زندگی آنها هیچ مرحله میانی از تبدیل به DNA وجود ندارد. برای تشخیص RNA، ابتدا باید به شکل DNA تبدیل شود. برای این کار از ترانس کریپتاز معکوس استفاده می شود که از دو ویروس مختلف جدا شده است: ویروس میلوبلاستوز پرندگان و ویروس لوسمی موش مولونی. استفاده از این آنزیم ها مشکلاتی را ایجاد می کند. اول از همه، آنها حرارت پذیر هستند و بنابراین می توانند در دمای بالاتر از 42 درجه سانتیگراد استفاده شوند. از آنجایی که در این دما مولکول های RNA به راحتی ساختارهای ثانویه تشکیل می دهند، راندمان واکنش به طور قابل توجهی کاهش می یابد و طبق برآوردهای مختلف، تقریباً 5٪ است. تلاش‌هایی برای دور زدن این اشکال با استفاده از یک پلیمراز مقاوم در برابر حرارت به‌دست‌آمده از میکروارگانیسم گرمادوست Thermus Thermophilus، که فعالیت ترانس کریپتاز را در حضور منگنز 2+ نشان می‌دهد، به عنوان یک رونوشت معکوس انجام می‌شود. این تنها آنزیم شناخته شده ای است که قادر به نشان دادن فعالیت پلیمراز و ترانس کریپتاز است.

برای انجام یک واکنش رونویسی معکوس، مخلوط واکنش، درست مانند PCR، باید حاوی پرایمرهایی به عنوان پرایمر و مخلوطی از 4 dNTP به عنوان ماده ساختمانی باشد.

پس از انجام یک واکنش رونویسی معکوس، مولکول های cDNA حاصل می توانند به عنوان هدف برای PCR عمل کنند.

5. سازماندهی فرآیند فن آوری انجام PCR

حساسیت بالقوه بالای واکنش زنجیره ای پلیمراز، طراحی دقیق آزمایشگاه PCR را کاملا ضروری می کند. این به دلیل حادترین مشکل روش - آلودگی است.

آلودگی ورود از محیط خارجی به مخلوط واکنش مولکول های DNA خاص است که می تواند به عنوان هدف در واکنش تقویت عمل کند و نتایج مثبت کاذب بدهد.

راه های مختلفی برای مبارزه با این پدیده ناخوشایند وجود دارد. یکی از آنها استفاده از آنزیم N-uracil glycosylase (UG) است. این روش مبتنی بر توانایی UG برای بریدن مولکول های DNA با اوراسیل جاسازی شده است. واکنش تقویت با استفاده از مخلوط dNTP انجام می شود که در آن dTTP با اوراسیل جایگزین می شود و پس از چرخه حرارتی، تمام آمپلیکون های تشکیل شده در لوله آزمایش حاوی اوراسیل خواهند بود. اگر CG قبل از تقویت به مخلوط واکنش اضافه شود، آمپلیکون های وارد شده به مخلوط واکنش از بین می روند، در حالی که DNA بومی دست نخورده باقی می ماند و متعاقبا به عنوان یک هدف برای تقویت عمل می کند.

بنابراین، این روش تنها تا حدی منبع آلودگی را از بین می برد و در برابر نتایج مثبت کاذب تضمین نمی کند.

راه دیگر برای مبارزه با نتایج آلودگی کاهش قابل توجه تعداد چرخه های واکنش (تا 25-30 چرخه) است. اما حتی با این رویکرد، خطر به دست آوردن نتایج مثبت کاذب بالا است، زیرا در این حالت، در غیاب بازدارنده ها، به راحتی می توان محصول تقویت کننده را به دلیل آلودگی به دست آورد.

بنابراین، علی‌رغم مزایای اقدامات پیش‌تقویت با هدف غیرفعال کردن مولکول‌های DNA که باعث نتایج مثبت کاذب می‌شوند، رادیکال‌ترین راه‌حل، یک سازمان آزمایشگاهی سنجیده است.

نتیجه

روش PCR در حال حاضر بیشترین کاربرد را به عنوان روشی برای تشخیص انواع بیماری های عفونی دارد. PCR به شما امکان می دهد تا علت عفونت را شناسایی کنید حتی اگر نمونه گرفته شده برای تجزیه و تحلیل فقط حاوی چند مولکول DNA از پاتوژن باشد. PCR به طور گسترده در تشخیص زودهنگام عفونت HIV، هپاتیت ویروسی و غیره استفاده می شود. امروزه تقریبا هیچ عامل عفونی وجود ندارد که با استفاده از PCR نتوان آن را تشخیص داد.