La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo estremamente accurato per rilevare agenti infettivi specifici. Analisi PCR: cos'è: come e dove donare i Primer per PCR

Polimerasi reazione a catena(PCR)- un metodo sperimentale di biologia molecolare, che consiste in un'amplificazione specifica degli acidi nucleici indotta da primer oligonucleotidici sintetici in vitro.

L'idea di sviluppare il metodo PCR appartiene al ricercatore americano Kary Mullis, che nel 1983 creò un metodo che consentiva di amplificare il DNA durante le duplicazioni cicliche utilizzando l'enzima DNA polimerasi in condizioni artificiali. Alcuni anni dopo la pubblicazione di questa idea, nel 1993, K. Mullis ricevette il Premio Nobel per questo.

All'inizio dell'utilizzo del metodo, dopo ogni ciclo di riscaldamento-raffreddamento, era necessario aggiungere la DNA polimerasi alla miscela di reazione, poiché questa veniva rapidamente inattivata quando alta temperatura. La procedura era molto inefficiente e richiedeva molto tempo ed enzimi. Nel 1986, è stato significativamente modificato utilizzando la DNA polimerasi di batteri termofili. Questi enzimi sono in grado di resistere a molti cicli di reazione, il che rende possibile automatizzare la PCR. Una delle DNA polimerasi termostabili più comunemente usate è stata isolata dai batteri Thermus acquatico e nominato Taq-DNA polimerasi.

L'essenza del metodo. Il metodo si basa sulla copiatura selettiva ripetuta di una specifica sezione di DNA utilizzando l'enzima Taq DNA polimerasi. La reazione a catena della polimerasi consente di ottenere amplificatori lunghi fino a diverse migliaia di paia di basi. Per aumentare la lunghezza del prodotto PCR a 20-40 mila paia di basi, viene utilizzata una miscela di varie polimerasi, ma questa è ancora significativamente inferiore alla lunghezza del DNA cromosomico di una cellula eucariotica.

La reazione viene eseguita in un termostato programmabile (amplificatore), un dispositivo che può funzionare abbastanza rapidamente

raffreddamento e riscaldamento delle provette (solitamente con una precisione di almeno 0,1 °C). Gli amplificatori consentono di impostare programmi complessi, inclusa la possibilità di “hot start” e successiva memorizzazione. Per la PCR in tempo reale vengono prodotti dispositivi dotati di un rilevatore fluorescente. Esistono anche dispositivi con coperchio automatico e vano per micropiastre, che ne consente l'integrazione in sistemi automatizzati.

Tipicamente, quando si esegue la PCR, vengono eseguiti 20-45 cicli, ciascuno dei quali consiste di tre fasi: denaturazione, ricottura del primer, allungamento (Fig. 6.1 e 6.2). Nella fig. La Figura 6.1 mostra la dinamica delle variazioni di temperatura nella provetta durante il ciclo PCR.

Riso. 6.1. Grafico delle variazioni di temperatura in una provetta durante un ciclo di reazione a catena della polimerasi

Denaturazione del modello di DNA viene effettuata riscaldando la miscela di reazione a 94-96 °C per 5-90 s in modo che le catene di DNA si separino. È da notare che prima del primo ciclo, la miscela di reazione viene preriscaldata per 2-5 minuti per denaturare completamente la matrice iniziale, il che consente di ridurre la quantità di prodotti di reazione non specifici.

Riso. 6.2. Schema del primo ciclo della reazione a catena della polimerasi

Fase di ricottura del primer. Con una graduale diminuzione della temperatura, i primer si legano in modo complementare alla matrice. La temperatura di ricottura dipende dalla composizione dei primer e solitamente è inferiore di 4-5° rispetto alla temperatura di fusione calcolata. La durata della fase è di 5-60 s.

Durante la fase successiva - allungamento- La sintesi del filamento di DNA figlia avviene sulla matrice madre. La temperatura di allungamento dipende dalla polimerasi. Le DNA polimerasi comunemente usate Taq e Pfu sono più attive a 72°C. Il tempo di allungamento, che dipende principalmente dalla lunghezza del prodotto PCR, è tipicamente di 1 minuto per mille paia di basi.

GOU VPO "Accademia medica statale di Krasnoyarsk"

prende il nome da Yasenetsky Agenzia federale sulla salute e lo sviluppo sociale"

Dipartimento di Genetica Medica e Neurofisiologia Clinica IPO

PRINCIPI FONDAMENTALI DEL METODO

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Manuale metodologico per studenti di 3-4 anni

nelle specialità di medicina generale (060101) e

Krasnojarsk – 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Principi di base del metodo di reazione a catena della polimerasi. Manuale metodologico per il lavoro extrascolastico degli studenti di 3-4 anni nelle specialità di medicina generale (060101) e pediatria (060103). – Krasnoyarsk: Casa editrice dell'Istituto statale di istruzione professionale superiore KrasSMA, 2007. – 42 p.

Il manuale metodologico è pienamente conforme ai requisiti della norma statale (2000) e ne riflette gli aspetti principali metodo moderno diagnostica malattie ereditarie umano – metodo della reazione a catena della polimerasi, materiale didattico adattato tecnologie educative tenendo conto delle specificità della formazione in 3-4 anni delle facoltà di medicina e pediatria.

Revisori: Capo del Dipartimento di Genetica Medica, Istituto statale di istruzione professionale superiore

"Università medica statale di Novosibirsk dell'Agenzia federale per la salute e lo sviluppo sociale", dottore in scienze mediche, professore;

replicazione del DNA

L'oggetto di studio di questo metodo è l'acido desossiribonucleico (DNA). Il DNA è il vettore universale dell'informazione genetica in tutti gli organismi esistenti sulla Terra (ad eccezione dei microrganismi contenenti RNA). Il DNA è un doppio filamento attorcigliato ad elica. Ogni filamento è costituito da nucleotidi collegati in sequenza. I filamenti di DNA hanno direzioni opposte: l'estremità da 5" di un filamento corrisponde all'estremità da 3" del secondo filamento. Una proprietà unica del DNA è la sua capacità di raddoppiarsi. Questo processo si chiama replica. La replicazione della molecola di DNA avviene durante il periodo sintetico dell'interfase. Ciascuna delle due catene della molecola “madre” funge da modello per la “figlia”. Dopo la replicazione, la molecola di DNA appena sintetizzata contiene un filamento “madre” e il secondo è un filamento “figlia” appena sintetizzato (metodo semi-conservativo). Per la sintesi del modello di una nuova molecola di DNA, è necessario che la vecchia molecola venga dispirata e allungata. La replicazione inizia in diversi punti della molecola del DNA. Viene chiamata la sezione di una molecola di DNA dal punto iniziale di una replicazione al punto iniziale di un'altra replicone.

L'avvio della replica è attivato primer(primer) costituiti da 100-200 coppie di nucleotidi. L'enzima DNA elicasi svolge e divide l'elica del DNA madre in due filamenti, sui quali, secondo il principio di complementarità, con la partecipazione dell'enzima DNA polimerasi, vengono assemblati i filamenti di DNA “figlia”. Affinché l'enzima possa iniziare il suo lavoro, è necessaria la presenza di un blocco di partenza: un piccolo frammento iniziale a doppio filamento. Il blocco di partenza è formato dall'interazione del primer con la regione complementare del filamento corrispondente del DNA genitore. In ciascun replicone, la DNA polimerasi può muoversi lungo il filamento “madre” in una sola direzione (5`=>3`).

Sul filo principale, man mano che il replicone si svolge, un filo “figlia” cresce gradualmente in modo continuo. Sul filamento ritardato, anche il filamento figlia si sintetizza nella direzione (5`=>3`), ma in frammenti separati man mano che il replicone si svolge.

Pertanto, l'aggiunta di nucleotidi complementari dei filamenti “figlia” avviene in direzioni opposte (antiparallele). La replica in tutti i repliconi avviene simultaneamente. Frammenti e parti di filamenti “figli” sintetizzati in diversi repliconi vengono cuciti in un unico filamento dall'enzima ligasi. La replicazione è caratterizzata da semi-conservatività, antiparallelismo e discontinuità. L'intero genoma di una cellula viene replicato una volta durante un periodo di tempo corrispondente a un ciclo mitotico. Come risultato del processo di replicazione, da una molecola di DNA si formano due molecole di DNA, in cui un filamento proviene dalla molecola di DNA madre e il secondo, figlia, appena sintetizzata (Fig. 1).

Riso. 1. Schema di replicazione della molecola di DNA.

Pertanto, il ciclo di replicazione del DNA include tre fasi principali:

1. svolgimento dell'elica del DNA e divergenza dei filamenti (denaturazione);

2. fissaggio dei primer;

3. completare la catena del thread figlio.

Principio del metodo PCR

È la replicazione del DNA che costituisce la base della PCR. Nella PCR, i processi di cui sopra vengono eseguiti in una provetta in modalità ciclica. Il passaggio da uno stadio di reazione all'altro si ottiene modificando la temperatura della miscela di incubazione. Quando la soluzione viene riscaldata a 93-95°C, avviene la denaturazione del DNA. Per procedere alla fase successiva - l'aggiunta o la "ricottura" dei primer - la miscela di incubazione viene raffreddata a 50-65°C. Successivamente, la miscela viene riscaldata a 70-72°C - la temperatura ottimale per la taq-DNA polimerasi - in questa fase avviene la costruzione di un nuovo filamento di DNA. Quindi il ciclo si ripete di nuovo. In altre parole il metodo PCR prevede un aumento multiplo del numero di copie (amplificazione) una sezione specifica di DNA catalizzata dall'enzima DNA polimerasi.

La crescita dei filamenti di DNA figlia deve avvenire simultaneamente su entrambi i filamenti del DNA materno, quindi anche la replicazione del secondo filamento richiede il proprio primer. Pertanto, alla miscela di reazione vengono aggiunti due primer: uno per la catena “+”, il secondo per la catena “-”. Essendo attaccati ai filamenti opposti della molecola di DNA, i primer si limitano alla parte di essa che verrà successivamente duplicata o amplificata molte volte. La lunghezza di un tale frammento, chiamato amplicone, è solitamente di diverse centinaia di nucleotidi.

Fasi della PCR

Ogni ciclo di amplificazione comprende 3 fasi, che si verificano in tempi diversi condizioni di temperatura(Fig. 2).

· Fase 1: Denaturazione del DNA . Si verifica a 93-95° per 30-40 secondi.

· Fase 2: ricottura del primer . L'attacco dei primer avviene in modo complementare alle sequenze corrispondenti sui filamenti opposti del DNA ai confini di una regione specifica. Ogni coppia di primer ha una propria temperatura di ricottura, i cui valori sono compresi tra 50 e 65°C. Tempo di ricottura 20-60 sec.

· Fase 3: completamento delle catene di DNA. Il completamento complementare delle catene di DNA avviene dall'estremità da 5" all'estremità da 3" della catena in direzioni opposte, a partire dai siti di attacco dei primer. Il materiale per la sintesi di nuove catene di DNA sono i trifosfati desossiribonucleosidici aggiunti alla soluzione. Il processo di sintesi è catalizzato dall'enzima taq polimerasi e avviene ad una temperatura di 70-72°C. Il tempo di sintesi è di 20-40 secondi.

Le nuove catene di DNA formate nel primo ciclo di amplificazione fungono da modelli per il secondo ciclo di amplificazione, in cui si forma uno specifico frammento di amplicone di DNA (Fig. 3). Nei successivi cicli di amplificazione, gli ampliconi fungono da modello per la sintesi di nuove catene.

Pertanto, l'accumulo di ampliconi nella soluzione avviene secondo la formula 2", dove n è il numero di cicli di amplificazione. Pertanto, anche se la soluzione iniziale inizialmente conteneva solo una molecola di DNA a doppio filamento, quindi in 30-40 cicli circa Nella soluzione si accumulano 108 molecole di amplicone, una quantità sufficiente per un rilevamento visivo affidabile di questo frammento mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Il processo di amplificazione viene effettuato in uno speciale cronotermostato ( termociclatore), che, secondo un determinato programma, modifica automaticamente le temperature in base al numero di cicli di amplificazione.

Per effettuare l'amplificazione sono necessari i seguenti componenti:

· Matrice del DNA(DNA o parte di esso contenente il frammento specifico desiderato);

· Primer(oligonucleotidi sintetici (20-30 coppie di nucleotidi), complementari alle sequenze di DNA ai confini dello specifico frammento da determinare). La scelta di un frammento specifico e la selezione dei primer svolgono un ruolo fondamentale nella specificità dell'amplificazione, che influisce sulla qualità dell'analisi.

· Miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTP)(una miscela di quattro dNTP, che costituiscono il materiale per la sintesi di nuove catene di DNA complementari in concentrazioni equivalenti di 200-500 µM)

· EnzimaTaq-polimerasi(DNA polimerasi termostabile che catalizza l'allungamento delle catene di primer mediante aggiunta sequenziale di basi nucleotidiche alla catena in crescita del DNA sintetizzato, 2-3 mM).

· Soluzione tampone(mezzo di reazione contenente ioni Mg2+ necessari per mantenere l'attività enzimatica, pH 6,8-7,8).

Per identificare regioni specifiche del genoma dei virus a RNA, una copia del DNA viene prima ottenuta da uno stampo di RNA utilizzando una reazione di trascrizione inversa (RT) catalizzata dall'enzima revertasi (trascrittasi inversa).

Riso. 2. Amplificazione (1° ciclo).

Riso. 3. Amplificazione (2° ciclo).

Principali applicazioni della PCR

· medicina Clinica:

o diagnosi di infezioni,

o rilevamento di mutazioni, inclusa la diagnosi di malattie ereditarie,

o genotipizzazione, inclusa la genotipizzazione HLA,

o tecnologie cellulari

· ecologia (come modo per monitorare la condizione e la qualità degli oggetti ambientali e dei prodotti alimentari)

· determinazione di organismi transgenici (OGM)

Identificazione personale, accertamento della paternità, analisi forense

· biologia generale e specifica,

Principi di base

organizzazione dei laboratori diagnostici

Il lavoro nel laboratorio PCR viene svolto in conformità con le “Regole di progettazione, precauzioni di sicurezza, igiene industriale, regime antiepidemico e igiene personale quando si lavora nei laboratori (dipartimenti, dipartimenti) di istituzioni sanitarie ed epidemiologiche del sistema sanitario.

Contaminazione dei campioni di DNA

L'esecuzione della diagnostica PCR è associata a un problema dovuto all'elevata sensibilità del metodo: la possibilità contaminazione. L'ingresso nella provetta di reazione di tracce di DNA positivo (prodotti specifici di amplificazione del DNA - ampliconi; standard di DNA utilizzato come controllo positivo; DNA positivo da un campione clinico) porta all'amplificazione di uno specifico frammento di DNA durante la PCR e, di conseguenza , all'apparenza risultati falsi positivi.

Nel processo di lavoro potresti incontrare due tipi di contaminazione:

1. contaminazione incrociata da campione a campione (durante l'elaborazione di campioni clinici o quando si scioglie la miscela di reazione), portando a sporadici risultati falsi positivi;

2. contaminazione con prodotti di amplificazione(ampliconi) avere valore più alto, perché durante il processo PCR gli ampliconi si accumulano in grandi quantità e sono prodotti ideali per la riamplificazione.

La contaminazione di vetreria, pipette automatiche e attrezzature di laboratorio, la superficie dei banchi di laboratorio o anche la superficie della pelle degli operatori di laboratorio con tracce di ampliconi porta a risultati sistematicamente falsi positivi. Determinare la fonte di contaminazione può essere molto difficile e richiede un notevole investimento di tempo e denaro. L'esperienza finora maturata nei laboratori che utilizzano il metodo PCR per la diagnostica ci consente di formulare i requisiti di base per l'organizzazione di tali laboratori e la conduzione delle analisi stesse. Il rispetto di questi requisiti elimina la possibilità di contaminazione e risultati falsi positivi.

Fasi dell'analisi PCR

Vengono separati geograficamente posizionandoli in stanze separate (Fig. 4, 5):

· Sala pre-PCR, dove si processano i campioni clinici, si isola il DNA, si prepara una miscela di reazione per la PCR e si esegue la PCR (se sussistono le condizioni, si consiglia di eseguire anche le ultime due fasi in un'ulteriore stanza separata). In questi locali è vietato svolgere tutti gli altri tipi di lavoro con agenti di test, la cui diagnostica PCR viene eseguita in questo laboratorio.

· Sala post-PCR, dove viene effettuato il rilevamento dei prodotti di amplificazione. In questa stanza possono essere utilizzati altri metodi di rilevamento. Si consiglia di posizionare la sala di rilevamento del prodotto di amplificazione il più lontano possibile dalle sale pre-PCR.

I laboratori sono dotati di lampade ultraviolette con una radiazione massima nell'ordine di 260 nm (tipo DB-60) con una potenza di 2,5 W per 1 m3. Le lampade sono posizionate in modo che le superfici dei tavoli di lavoro, delle attrezzature e dei materiali con cui l'operatore entra in contatto durante l'analisi PCR siano esposte all'irradiazione diretta. L'irradiazione viene effettuata entro 1 ora prima dell'inizio del lavoro ed entro 1 ora dopo la fine del lavoro.

I medici di laboratorio lavorano con indumenti speciali da laboratorio, che vengono cambiati quando si spostano da una stanza all'altra, e con guanti monouso. I vestiti di stanze diverse vengono elaborati separatamente. Diversi dipendenti lavorano in diverse fasi dell'analisi PCR.

Per il lavoro vengono utilizzati set separati di dispenser, plastica e vetreria, attrezzature da laboratorio, camici e guanti, destinati alle varie fasi di analisi e non trasportabili da una stanza all'altra. Attrezzature, materiali e forniture presenti in ogni locale sono opportunamente segnalati.

Tutte le fasi del lavoro vengono eseguite solo utilizzando materiali di consumo usa e getta: puntali per pipette automatiche, provette, guanti, ecc. Assicurati di cambiare puntali quando ti sposti da un campione all'altro. È necessario utilizzare puntali con un filtro, una barriera antiaerosol per impedire l'ingresso di microgoccioline della soluzione nella pipetta. Tubi e puntali usati vengono smaltiti in appositi contenitori o contenitori contenenti una soluzione disinfettante. I campioni clinici vengono conservati separatamente dai reagenti.

Per la lavorazione e la pulizia degli ambienti di lavoro, ogni locale è dotato di tamponi di garza di cotone (salviette), pinzette, soluzioni disinfettanti e inattivanti.

Dal laboratorio diagnostico PCR sono esclusi i lavori relativi alla produzione (clonazione) e all'isolamento di plasmidi ricombinanti contenenti sequenze di DNA o frammenti di geni di agenti patogeni diagnosticati in questo laboratorio.

Raccolta di materiale clinico

Il materiale da studiare per la PCR può essere raschiato di cellule epiteliali, sangue, plasma, siero, liquidi pleurici e cerebrospinali, urina, espettorato, muco e altre secrezioni biologiche, biopsie.

Il materiale viene raccolto in una sala di trattamento del profilo appropriato. Dopo la raccolta, i campioni devono essere consegnati al laboratorio diagnostico PCR il prima possibile.

I campioni devono essere prelevati utilizzando strumenti sterili, preferibilmente monouso, esclusivamente in provette di plastica sterili monouso o provette di vetro, pretrattate per un'ora con una miscela di cromo, lavate accuratamente con acqua distillata e calcinate in armadio di essiccazione alla temperatura di 150°C. per 1 ora.

Zona di rilevamento (un altro piano o un altro edificio).

Riso. 4. Dispositivo da laboratorio per PCR con rilevamento mediante elettroforesi.

Zona di rilevamento (un altro piano o un altro edificio)

Riso. 5. Dispositivo da laboratorio per PCR con rilevamento fluorescente (analisi quantitativa).

Riso. 6. Sala di estrazione del DNA. Viene mostrata una scatola da tavolo con una lampada germicida.

Riso. 7. Sala di amplificazione.

Riso. 8. Sala di rilevamento.

Riso. 9. Prelievi di sangue per la diagnostica del DNA di malattie ereditarie.

Conservazione e trasporto dei campioni

Per diagnosticare le malattie ereditarie, i campioni di sangue vengono conservati per lungo tempo su speciali moduli cartacei o in epindorf (tubi di plastica) allo stato congelato (Fig. 9).

Per la diagnostica malattie infettive i campioni vengono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 ore. Se è necessaria una conservazione più lunga, i campioni possono essere collocati in frigorifero a una temperatura di 2-8°C per un periodo non superiore a un giorno. Una conservazione più lunga (fino a 2 settimane) è consentita congelata nel congelatore a una temperatura di meno 20°C. Non è consentito il congelamento e lo scongelamento ripetuto dei campioni.

Se il laboratorio diagnostico PCR e la sala procedurale per il campionamento sono geograficamente separati, il trasporto dei campioni deve essere effettuato in thermos o contenitori termici in conformità con le regole per la conservazione dei campioni e le regole per il trasporto di materiali infetti.

Estrazione del DNA da campioni

Si è diffuso il metodo di assorbimento in fase solida, che consiste nell'aggiunta di un agente di lisi contenente una soluzione di guanidina, assorbimento del DNA su un assorbente, lavaggi ripetuti e riassorbimento del DNA con una soluzione tampone. Quando si processano siero, plasma o sangue intero, viene solitamente utilizzato il metodo di estrazione con fenolo. Il metodo prevede la deproteinizzazione con fenolo/cloroformio seguita dalla precipitazione del DNA (o RNA) con etanolo o isopropanolo. La lavorazione viene effettuata in provette per microcentrifuga Eppendor P con un volume di 1,5 ml. Il tempo di lavorazione è di 1,5-2 ore (Fig. 10).

Riso. 10. Estrazione del DNA.

Esecuzione della PCR

Una certa quantità di campione dal campione clinico trattato viene trasferita in una speciale provetta per microcentrifuga del tipo Eppendorf con un volume di 0,2 o 0,5 ml. Viene aggiunta una miscela di amplificazione composta da acqua, tampone PCR, soluzione dNTP, soluzione di primer e soluzione stessa provetta. Taq polimerasi (aggiunta alla miscela per ultima) In genere, il volume della miscela di reazione è di 25 μl. Quindi viene aggiunta una goccia di olio minerale a ciascuna provetta per prevenire l'evaporazione della miscela di reazione durante il processo di amplificazione vengono trasferiti ad un cronotermostato (amplificatore), dove l'amplificazione viene eseguita automaticamente secondo un determinato programma (Fig. 11).

Riso. undici. Amplificatore" Termociclatore ».

Il tempo di reazione, a seconda del programma specificato, è di 2-3 ore. Parallelamente ai campioni sperimentali, vengono posizionati i campioni di controllo: il controllo positivo comprende tutti i componenti della reazione, ma al posto del materiale campione clinico viene aggiunta una preparazione di DNA di controllo del gene in studio. Il controllo negativo comprende tutti i componenti della reazione, ma al posto del materiale clinico o della preparazione del DNA viene aggiunta una quantità adeguata di acqua deionizzata o un estratto che non contiene il DNA da testare. Il controllo negativo è necessario per verificare l'assenza di DNA dovuta a contaminazione nei componenti della reazione e per escludere risultati falsi positivi.

Registrazione dei risultati

Il frammento di DNA specifico amplificato viene rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio in presenza di bromuro di etidio. Il bromuro di etidio forma un composto interstiziale stabile con frammenti di DNA, che appare sotto forma di bande luminose quando il gel viene irradiato con radiazioni UV con una lunghezza d'onda di 290-330 nm. A seconda della dimensione degli ampliconi formatisi in seguito alla PCR, viene utilizzato un gel con un contenuto di agarosio compreso tra 1,5% e 2,5%. Per preparare un gel di agarosio, una miscela di agarosio, tampone e acqua viene sciolta in un forno a microonde o a bagnomaria e viene aggiunta una soluzione di bromuro di etidio. La miscela, raffreddata a 50-60°C, viene versata nello stampo in uno strato di 4-6 mm di spessore e, mediante appositi pettini, vengono ricavate delle tasche nel gel per l'applicazione del campione. I pettini sono installati in modo tale che tra il fondo dei pozzetti e la base del gel rimanga uno strato di agarosio di 0,5-1 mm. Dopo che il gel si è indurito, l'amplificatore viene applicato alle tasche in una quantità di 5-15 μl. Si consiglia di eseguire l'elettroforesi di una miscela di marcatori di lunghezza dei frammenti di DNA in parallelo con i campioni di controllo e sperimentali. Tipicamente, una tale miscela contiene dieci frammenti di DNA di lunghezza 100, 200, 300, ecc. paia di basi.

L'utilizzo di tale test consente di verificare la lunghezza degli ampliconi nei campioni di controllo e sperimentali. Il gel con il campione applicato viene trasferito in una camera per elettroforesi riempita di tampone, la camera è collegata a una fonte di alimentazione e la separazione elettroforetica dei prodotti di amplificazione viene effettuata per 30-45 minuti con un'intensità del campo elettrico di 10-15 V/ cm. In questo caso il fronte del colorante compreso nella miscela di reazione deve percorrere almeno 3 cm.

Una volta completata l'elettroforesi, il gel viene trasferito su un transilluminatore di vetro e osservato sotto la luce ultravioletta. Per la documentazione, il gel viene fotografato su pellicola Micrat 300 o registrato utilizzando un sistema video collegato a un computer.

Innanzitutto vengono valutati i campioni di controllo. Nella traccia elettroforetica corrispondente al controllo positivo deve essere presente una banda arancione luminosa. La sua mobilità elettroforetica deve corrispondere alla lunghezza dell'amplicone specificata nelle istruzioni.

Nella traccia elettroforetica corrispondente al controllo negativo tale banda dovrebbe essere assente. La presenza di tale banda nel controllo negativo indica contaminazione - contaminazione dei reagenti utilizzati con il DNA o l'amplicone del test. I campioni di prova vengono valutati dalla presenza di una banda nella traccia corrispondente, che si trova allo stesso livello della banda nel campione di controllo positivo. L'intensità della banda corrisponde alla quantità di DNA analizzato nel campione, che consente una valutazione semiquantitativa della PCR. Generalmente risultati positivi valutato su una scala a quattro punti. Se la luminosità della banda nel campione di prova è molto debole, è necessario riorganizzare tale campione (Fig. 12).

Riso. 12. Elettroforesi su gel di agarosio.

Applicazioni della PCR perdiagnostica delle mutazioni puntiformi e dei polimorfismi genici

Uno dei principali ambiti di applicazione della PCR nella pratica sanitaria è la diagnosi di mutazioni puntiformi e polimorfismi genici . Esistono metodi diretti e indiretti di diagnostica del DNA. Nelle situazioni in cui è noto un gene, il cui danno porta allo sviluppo di una malattia ereditaria, questo danno può essere rilevato mediante metodi di genetica molecolare. Tali metodi sono chiamati diretti. Utilizzando metodi diretti, vengono rilevate irregolarità nella sequenza nucleotidica primaria del DNA (mutazioni e loro tipi). I metodi diretti sono caratterizzati da una precisione che raggiunge quasi il 100%.

Tuttavia, nella pratica, questi metodi possono essere utilizzati a determinate condizioni:

· con localizzazione citogenetica nota del gene responsabile dello sviluppo di una malattia ereditaria;

· è necessario clonare il gene patogeno e conoscerne la sequenza nucleotidica.

Lo scopo della diagnostica diretta del DNA è identificare gli alleli mutanti.

Pertanto, in situazioni in cui è noto quale tipo di danno al DNA porta a una malattia ereditaria, il frammento di DNA contenente il danno viene esaminato direttamente, cioè viene utilizzato il metodo diagnostico diretto del DNA.

Tuttavia, ad oggi, i geni di molte malattie non sono stati mappati, la loro organizzazione esone-introne è sconosciuta e molte malattie ereditarie sono caratterizzate da una pronunciata eterogeneità genetica, che non consente il pieno utilizzo dei metodi diagnostici diretti sul DNA. Pertanto, nei casi in cui la localizzazione del danno è sconosciuta, viene utilizzato un altro approccio, legato allo studio della vicinanza del gene responsabile della malattia genetica, in combinazione con l'analisi familiare, cioè metodi indiretti di diagnosi genetica molecolare di vengono utilizzate le malattie ereditarie.

Per rilevare mutazioni puntiformi e piccole delezioni possono essere utilizzati vari metodi, ma tutti si basano sul metodo PCR. Questa reazione consente di moltiplicare più volte la sequenza nucleotidica del DNA e quindi di cercare le mutazioni. I metodi per la ricerca di frammenti di DNA portatori di mutazioni si basano su un'analisi comparativa di sequenze nucleotidiche di DNA mutanti e normali.

Analisi dei prodotti della PCR

nel processo di diagnostica diretta del DNA

Implica lo studio di caratteristiche specifiche della regione del gene amplificato. Pertanto, nelle malattie causate dall'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche, i prodotti di amplificazione differiscono nella loro lunghezza (riflettendo il diverso numero di triplette nella regione del gene studiato) e, di conseguenza, nella loro velocità di movimento nel gel. Grazie a ciò si ottiene una chiara separazione elettroforetica degli alleli normali e mutanti e una determinazione accurata di un frammento patologicamente allungato, cioè la diagnosi del DNA della malattia (Fig. 13).

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Riso. 14. Diagnosi di cancellazione BAVAGLIO nel gene DYT 1 in pazienti con distonia dopa-indipendente (elettroforesi su gel di poliacrilammide). Corsie 2,3,6 – malati; tracce 1,4,5 – controllo. La freccia sottile indica l'allele normale, la freccia spessa indica l'allele più corto mutante (delezione di tre nucleotidi).

Se l'intera regione del DNA in studio fa parte di una delezione estesa, l'amplificazione PCR del DNA da questo allele eliminato non verrà eseguita a causa della mancanza di siti per l'ibridazione dei primer. In questo caso verrà diagnosticata una delezione omozigote sulla base della completa assenza di un prodotto della reazione PCR (la sintesi del DNA è impossibile da entrambe le copie del gene). Con una delezione eterozigote, è possibile rilevare un prodotto della PCR sintetizzato da un allele normale (trattenuto), tuttavia, per diagnosticare in modo affidabile tale mutazione, è necessario utilizzare metodi di imaging del DNA più complessi che consentano di stimare la dose della PCR finale; Prodotto.

Per identificare le mutazioni puntiformi (il più delle volte sostituzioni nucleotidiche) in determinati siti, il metodo PCR viene utilizzato in combinazione con altri metodi di analisi genetica molecolare. Se la posizione e la natura della presunta mutazione puntiforme sono note con precisione, allora il endonucleasi di restrizione (enzimi di restrizione) sono speciali enzimi cellulari isolati da vari ceppi di batteri.

Questi enzimi riconoscono sequenze nucleotidiche specifiche di lunghezza compresa tra quattro e dieci nucleotidi. Successivamente viene eseguita la restrizione (lat. (taglio)) di queste sequenze come parte di una molecola di DNA a doppio filamento. Ciascun enzima di restrizione riconosce e taglia in un punto fisso una sequenza nucleotidica specifica rigorosamente definita. sito di restrizione (sito di riconoscimento).

Nei casi in cui una mutazione puntiforme modifica il sito di riconoscimento naturale per un particolare enzima di restrizione, questo enzima non sarà in grado di scindere il frammento mutante amplificato dalla PCR. In alcuni casi, una mutazione porta alla comparsa di un nuovo sito di riconoscimento per un particolare enzima di restrizione che normalmente è assente.

In entrambe le situazioni, i prodotti di PCR mutanti e normali trattati con l'enzima di restrizione selezionato produrranno frammenti di restrizione di diversa lunghezza, che possono essere facilmente rilevati mediante elettroforesi (Fig. 15).

Pertanto, se è necessario rilevare rapidamente una specifica mutazione puntiforme, il compito si riduce alla ricerca dell'enzima di restrizione corrispondente, il cui sito di riconoscimento è localizzato nel sito della sequenza nucleotidica interrotta. Il trattamento dei prodotti della PCR con tale enzima di restrizione consentirà di differenziare facilmente gli alleli normali e mutanti. L'analisi di restrizione semplifica notevolmente l'individuazione di mutazioni puntiformi note ed è ora ampiamente utilizzata per la diagnosi diretta del DNA di malattie ereditarie.

La fase finale analisi genetica molecolare delle mutazioni consiste nel determinare la sequenza nucleotidica del frammento di DNA in studio (sequenziamento), che viene confrontata con la norma e viene formulata una diagnosi genetica finale. Grazie ai successi della genetica molecolare sono stati sviluppati metodi diagnostici basati sul DNA per oltre 400 malattie ereditarie.

Riso. 15. Rilevamento della mutazione puntiforme mediante analisi di restrizione: A – regione del gene amplificato contenente un sito di restrizioneAGCTper l’endonucleasi di restrizioneAlu IO. MutazioneG→ UNmodifica questa sequenza nucleotidica, dando origine all'enzima di restrizioneAluIbloccato; B – elettroferogramma dei prodotti di restrizione: traccia 1 – omozigosità per l'allele normale; traccia 2 – omozigosità per mutazione; traccia 3 – stato eterozigote (allele normale + mutazione).

La diagnosi delle malattie ereditarie, basata sullo studio diretto degli alleli mutanti nei pazienti, nei loro familiari o sospetti portatori eterozigoti di mutazioni patologiche, è adatta per la diagnosi presintomatica e prenatale, che può essere utilizzata al massimo fasi iniziali sviluppo fetale, prima della comparsa di qualsiasi sintomo clinico o biochimico della malattia.

Indipendentemente dal metodo di rilevamento della mutazione, le caratteristiche molecolari precise di ciascuna mutazione possono essere ottenute solo mediante sequenziamento diretto. Per automatizzare questo processo in l'anno scorso Sono ampiamente utilizzati dispositivi speciali: sequenziatori, che consentono di accelerare significativamente il processo di lettura delle informazioni sul DNA.

La strada verso un più ampio utilizzo della ricerca biologica molecolare nei laboratori diagnostici clinici viene aperta accelerando il processo analitico eseguendo tutte le procedure in un unico continuum, senza trasferimento del campione, creando le condizioni per prevenire la contaminazione durante i test paralleli di un numero di analiti e registrando oggettivamente il risultati in ogni ciclo.

Principali modifiche del metodo PCR

Utilizzato per scansionare e cercare rapidamente mutazioni genetiche note.

PCR multiplex (multiprimer).

Questo metodo si basa sull'amplificazione simultanea di diversi esoni del gene in studio in un'unica reazione. Ciò consente uno screening rapido ed economicamente vantaggioso delle mutazioni più comuni. Ad esempio, per diagnosticare rapidamente la presenza di delezioni nel gene della distrofina in pazienti con distrofia muscolare progressiva di Duchenne/Becker, viene effettuata l'amplificazione simultanea di un insieme degli esoni più frequentemente mutati di questo gene. Poiché queste malattie sono ereditate con modalità recessiva legata all'X e sono associate a danni all'unico cromosoma X nei ragazzi, in caso di delezione estesa, l'elettroforesi dei prodotti della reazione rivelerà l'assenza di uno o più frammenti di DNA (esoni ), che può servire come conferma molecolare della diagnosi. Inoltre, selezionando sezioni genetiche specifiche per l'amplificazione mediante PCR, è possibile una valutazione abbastanza accurata della lunghezza totale della delezione e dei breakpoint genici (fino all'esone).

L'uso combinato di diverse reazioni multiplex rende possibile diagnosticare fino al 98% di tutte le delezioni che si verificano in pazienti con distrofia muscolare progressiva di Duchenne/Becker. Questo è circa il 60% di numero totale mutazioni note nel gene della distrofina e indica l'altissima efficienza di questo metodo di screening per la diagnosi del DNA delle distrofinopatie (Fig. 16).

Riso. 16. Diagnosi diretta del DNA della distrofia muscolare di Duchenne mediante PCR multiplex (elettroforesi su gel di agarosio). In ciascuno degli individui esaminati sono stati amplificati contemporaneamente quattro esoni del gene della distrofina (esoni 17, 19, 44 e 45; le frecce indicano i corrispondenti prodotti di amplificazione). Corsia 1 – controllo, corsie 2-5 – pazienti con distrofia muscolare di Duchenne con varie delezioni del gene della distrofina (corsie 2 e 5 – delezione dell'esone 45, traccia 3 – delezione dell'esone 44, traccia 4 – delezione degli esoni 17 e 19 ).

Amplificazione allele-specifica

Il metodo si basa sull'uso di due coppie indipendenti di primer per una regione genetica specifica: un primer in entrambe le coppie è comune e il secondo primer in ciascuna coppia ha una struttura diversa ed è complementare a una sequenza di DNA normale o mutante. Come risultato di tale reazione, due tipi di prodotti PCR possono essere sintetizzati contemporaneamente in soluzione: normale e mutante. Inoltre, il design dei primer utilizzati consente di differenziare chiaramente i prodotti di amplificazione normali e mutanti in base alla loro dimensione molecolare. Questo metodo è molto visivo e consente di verificare la presenza sia omo che eterozigote dell'allele mutante.

Metodo per la modifica sito-diretta del DNA amplificato

Il metodo si basa sull'uso di un cosiddetto primer di mismatch nella PCR (non completamente complementare al modello), che differisce dalla sequenza del DNA modello per un nucleotide. Come risultato dell'inclusione del primer specificato nel prodotto PCR mutante, in esso si forma un sito di restrizione creato artificialmente per una delle endonucleasi di restrizione, che consente la diagnosi diretta del DNA di una determinata mutazione nota mediante l'analisi di restrizione. La creazione di un tale sito di restrizione artificiale è necessaria se la ricerca non ha rivelato l'esistenza di un enzima noto e disponibile, il cui sito di restrizione “naturale” è interessato a causa della comparsa della mutazione studiata nella molecola di DNA .

Metodo PCR con trascrittasi inversa (RT- PCR)

Questo metodo viene utilizzato nei casi in cui è più conveniente utilizzare come oggetto di studio non il DNA genomico, ma un cDNA più compatto e ricco di informazioni ottenuto dopo un'adeguata elaborazione di campioni di tessuto, ad esempio materiale bioptico o linee cellulari di linfociti, fibroblasti, ecc. Importante la condizione qui è l'espressione (almeno minima) del gene desiderato nel tessuto studiato.

Nella prima fase viene effettuata la trascrizione inversa dell'mRNA e le molecole di cDNA risultanti fungono da modello per la PCR. Successivamente, la regione critica del cDNA, amplificata in quantità sufficiente, viene sottoposta a sequenziamento e ad altri metodi di screening delle mutazioni, studio elettroforetico diretto (rilevamento di delezioni, inserzioni, ecc.) o integrazione in un sistema di espressione al fine di ottenere prodotto proteico e la sua analisi diretta.

Questo metodo è particolarmente efficace per rilevare mutazioni che portano alla sintesi di una proteina "troncata" (mutazioni non senso, mutazioni di splicing, grandi delezioni) - la cosiddetta analisi PTT (Protein Truncation Test). L'analisi PTT è comunemente utilizzata nello studio di geni multiesoni lunghi, come la distrofia muscolare di Duchenne/Becker, l'atassia-telangectasia o la neurofibromatosi di tipo 1.

PCR in tempo reale(PCR in tempo reale, inglese)

Ogni anno, la PCR in tempo reale sta diventando un metodo diagnostico sempre più popolare nella pratica sanitaria. La sua caratteristica fondamentale è il monitoraggio e l'analisi quantitativa dell'accumulo dei prodotti della reazione a catena della polimerasi e la registrazione e interpretazione automatica dei risultati ottenuti. Questo metodo non richiede una fase di elettroforesi, il che riduce i requisiti per un laboratorio PCR. Grazie al risparmio di spazio di produzione, alla riduzione del numero del personale e della domanda di determinazione quantitativa del DNA/RNA, questo metodo è stato utilizzato con successo negli ultimi anni nei più grandi centri sanitario-epidemiologici, diagnostici e di ricerca dei paesi sviluppati del mondo, sostituendo PCR nel suo formato attuale (“classico”).

La PCR in tempo reale utilizza sonde oligonucleotidiche marcate in modo fluorescente per rilevare il DNA mentre viene amplificato. La PCR in tempo reale consente l'analisi completa di un campione entro 20-60 minuti ed è teoricamente in grado di rilevare anche una molecola di DNA o RNA in un campione.

Riso. 17. PCR in tempo reale.

La PCR in tempo reale utilizza un sistema TaqMan che controlla la cinetica della PCR direttamente durante l'amplificazione utilizzando l'estinzione della fluorescenza per risonanza. Per la rilevazione viene utilizzata una sonda che trasporta un fluoroforo e un quencher complementare alla parte centrale del frammento amplificato. Quando il fluoroforo e il quencher sono legati alla sonda oligonucleotidica, si osserva solo una minore emissione fluorescente. Durante il processo di amplificazione, a causa dell'attività esonucleasica 5" della Taq polimerasi, il marcatore fluorescente entra in soluzione, liberato dalla sua vicinanza al quencher, e genera un segnale fluorescente che aumenta in tempo reale in proporzione all'accumulo dell'amplificatore ( Figura 17).

I principali vantaggi della Real-Time PCR rispetto alla PCR con elettroforesi su gel:

· L'intero metodo avviene in una provetta;

· Il metodo richiede 1 ora;

· Sono sufficienti 1-2 locali di lavoro;

· Insieme a valutazione qualitativa il risultato diventa quantificabile (ad esempio, quando si prescrive una terapia antivirale per l'AIDS o l'epatite virale, è necessario conoscere la carica virale, cioè la quantità di virus per unità, che viene fornita dalla real time PCR);

· Il rischio di contaminazione è nettamente ridotto.

Conclusione

Il metodo PCR è uno dei metodi più comuni di ricerca biologica molecolare. Questo metodo dovrebbe essere utilizzato in modo intelligente dai medici e un medico che decide di utilizzare la PCR nel suo lavoro deve avere una certa conoscenza delle caratteristiche e delle capacità di questo metodo. In secondo luogo, deve esserci uno stretto feedback tra il clinico e il laboratorio di PCR, necessario per analizzare casi complessi e sviluppare la corretta strategia diagnostica. In terzo luogo, l’analisi PCR non è una panacea nella diagnostica (soprattutto nelle malattie infettive) e non sostituisce i metodi di ricerca esistenti, ma li integra solo. E, cosa più importante, la PCR non può sostituire l’intuizione e il pensiero analitico che deve avere un medico che si aspetta il successo.

P . S . Ricerca biologica molecolare: modifica delle linee guida per la diagnosi e il trattamento. L'uso di metodi biologici molecolari è associato alla prospettiva di un cambiamento radicale nell'enfasi nella diagnostica di laboratorio. Potrebbe non trattarsi solo di informazioni tempestive, ma di riceverle in anticipo. Se ora i test di laboratorio nella maggior parte dei casi vengono eseguiti già quando la malattia si è sviluppata e il trattamento è iniziato, allora si prevede che le informazioni di laboratorio biologico molecolare consentano di identificare la predisposizione di una persona a determinati tipi di patologia e il grado di sensibilità a determinati farmaci , che giustificherà la natura predittiva, preventiva e personalizzata della medicina futura.

CAMBIAMENTO DELLA DIAGNOSI E ORIENTAMENTI DEL TRATTAMENTO

MALATTIE EREDITARIE

Oggi Nel futuro

Diagnosi Passaporto genetico

8. Quante stanze di lavoro sono necessarie per gestire un laboratorio PCR con rilevamento fluorescente (analisi quantitativa, PCR in tempo reale)?

9. Cos'è il rilevamento?

10. Quali metodi di diagnostica del DNA esistono?

11. Il lavoro di quale enzima è alla base della PCR?

12. Perché è necessario rimuovere la zona di rilevamento da altre aree di lavoro?

13. Cos'è un sito con restrizioni?

14. Quali sono le differenze tra i metodi diagnostici del DNA diretti e indiretti?

15. Cos'è il sequenziamento?

16. Cos'è la PCR multiplex?

17. Quali tipi di mutazioni vengono determinate utilizzando la PCR?

18. Cos'è la contaminazione?

19. Qual è l'essenza del metodo di amplificazione allele-specifico?

20. Condizioni di conservazione del materiale PCR?

21. In quale dispositivo avviene l'amplificazione?

22. Cos'è il metodo PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR)?

23. Cosa serve come materiale per la diagnostica PCR?

24. Elencare i tipi di contaminazione?

Test di autopreparazione

1. Enzimi di restrizione dell'endonucleasi:

a) enzimi che “spezzano” il DNA in luoghi strettamente specifici;

b) enzimi che uniscono le rotture nella molecola del DNA;

c) enzimi che forniscono composti che eseguono la riparazione del DNA.

2. Amplificazione genica:

3. Quale metodo di genetica molecolare viene utilizzato per diagnosticare le malattie causate da un gene mutante di sequenza nota?

a) uso di un enzima di restrizione specifico;

b) rilevazione diretta mediante specifiche sonde molecolari;

c) analisi familiare della distribuzione dei polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione normale.

4. Sequenziamento del DNA:

a) identificazione della sequenza di basi del DNA;

b) ripetizioni multiple di qualsiasi sezione di DNA;

c) isolamento di un frammento di DNA contenente il gene in studio.

5. Per ottenere campioni di DNA è possibile utilizzare :

b) villi coriali;

c) liquido amniotico;

d) cellule del liquido amniotico;

e) campioni bioptici di pelle, muscoli, fegato,

e) tutto è corretto tranne il punto “c”,

g) tutto è corretto tranne il punto “d”,

h) tutto quanto sopra è vero.

6. Per diagnosticare quali mutazioni viene utilizzato il metodo PCR:

a) genomico;

b) cromosomico;

c) gene (punto).

7. Il primer è:

a) sezione complementare del DNA;

b) una sequenza oligonucleotidica sintetica marcata (radioattivamente o in modo fluorescente) complementare ad un gene mutante o normale;

c) un oligonucleotide che funge da “primer” e avvia la sintesi di una catena polinucleotidica su una matrice di DNA o RNA.

8. Chi ha sviluppato il principio del metodo PCR?

b) K. Mullis

9. Il metodo PCR viene utilizzato per diagnosticare l'espansione delle ripetizioni trinucleotidiche (un tipo di mutazione dinamica)?

10. In quali aree viene utilizzata la PCR?

a) medicina clinica;

b) determinazione di organismi transgenici (OGM)

c) identificazione personale, accertamento della paternità, analisi forense

d) tutto quanto sopra,

e) nessuna delle precedenti...

Risposte di esempio: 1 – un; 2-b; 3-b; 4-a; 5-e; 6 – dentro; 7 – dentro; 8-b; 9 – a, 10 – g.

Principale

1.Genetica di Bochkov. Mosca. GEOTAR, 2002.

Ulteriori

1. , Bakharev e il trattamento delle malattie congenite ed ereditarie nei bambini. – Mosca, 2004.

2. Diagnostica del DNA e consulenza genetica medica. – Mosca, 2004.

3. Genetica Ginter. – Mosca, 2003.

4. Fondamenti di Gorbunov di genetica medica. – San Pietroburgo: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Diagnostica clinica molecolare. – Mondo, 1999.

6. Menshikov - ricerca biologica nella diagnostica clinica di laboratorio: possibilità del problema (lezioni frontali). Clinico diagnostica di laboratorio, № 3, 2006.

7. Il lavoro di Kornienko nel laboratorio PCR durante l'analisi in linea di materiale biologico. Diagnostica clinica di laboratorio, n. 10, 2006.

8. Organizzazione del lavoro del laboratorio PCR. Istruzioni metodiche. MU 1.3.1794-03. Capo Sanitario della Federazione Russa, 2003.

9. Tecnologia Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR quantitativa in tempo reale. Ricerca sul genoma – N. 6, 1996.

PRINCIPI FONDAMENTALI DEL METODO

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Manuale metodologico per il lavoro extrascolastico degli studenti di 3-4 anni nelle specialità di medicina generale (060101) e pediatria (060103).

Istituto statale di istruzione professionale superiore "Accademia medica statale di Krasnoyarsk dell'Agenzia federale per la salute e lo sviluppo sociale"

Russia, Krasnojarsk,

La reazione a catena della polimerasi è nota da 30 anni. È ampiamente utilizzato in molti campi, dall’archeologia alla genetica.

È il metodo PCR che aiuta a stabilire la paternità, ma viene spesso utilizzato per identificare varie malattie infettive nel corpo umano.

Come viene eseguita l'analisi PCR e che cos'è? Cercheremo di rispondere a queste domande in dettaglio.

Analisi PCR: che cos'è?

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo diagnostico genetico molecolare ad alta precisione che consente di identificare varie malattie infettive ed ereditarie nell'uomo, sia nella fase acuta che cronica, e molto prima che la malattia possa manifestarsi.

Il metodo PCR è assolutamente specifico e, se eseguito correttamente, non può dare un risultato falso positivo. Cioè, se non c'è infezione, l'analisi non mostrerà mai che esiste. Pertanto, ora molto spesso, per confermare la diagnosi, viene eseguito un ulteriore test PCR per determinare l'agente patogeno e la sua natura.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata sviluppata da Kary Mullis (USA) nel 1983, per la quale gli è stato assegnato il Premio Nobel per la Chimica nel 1993.

Qual è il vantaggio di questo metodo?

La diagnostica con questo metodo consente di trovare l'agente patogeno direttamente nel gene contenuto nei materiali in studio. Questo è il test più accurato per le infezioni a trasmissione sessuale, infezioni nascoste, varie malattie sessualmente trasmissibili.

Differenze tra la diagnostica PCR e altri metodi di ricerca di laboratorio sono come segue:

• il metodo è finalizzato all'identificazione dell'agente patogeno stesso;
• La diagnostica che utilizza il metodo PCR si distingue per la sua versatilità: per rilevare diversi agenti patogeni;
• malattie, è sufficiente un solo campione biologico del paziente;
• il metodo è altamente sensibile e non è accompagnato da altre reazioni crociate.

Inoltre, il vantaggio della diagnostica PCR è che qualsiasi materiale biologico del paziente è adatto per l'analisi: sangue, secrezioni genitali, urina, sperma.

Quali infezioni può rilevare uno striscio PCR?

Il corpo può contenere un gran numero di agenti infettivi, tra questi rientrano anche quelli “nascosti” che non si manifestano per molto tempo.

Analisi dello striscio PCR consente di rilevare tali infezioni:

• ureplasmosi degli organi genitali;
• candidosi();
• herpes;
• presenza di cellule tumorali;
• valutare lo stato ormonale;

Il materiale del test per la PCR è solitamente l'espettorato, la saliva, l'urina e il sangue. Prima di effettuare l'analisi, è necessario prepararsi attentamente consultando prima un medico.

Il sangue per la PCR viene solitamente donato a stomaco vuoto. Buoni risultati mostra l'analisi quando il materiale per la ricerca viene prelevato dal canale cervicale o dall'uretra. In questo caso, è meglio eseguire la diagnostica PCR entro e non oltre un giorno dal rapporto sessuale.

Tipi di PCR

La PCR viene utilizzata in molte aree per test ed esperimenti scientifici. Esistono diversi metodi di analisi:

1. PCR con trascrizione inversa(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - utilizzato per amplificare, isolare o identificare una sequenza nota da una libreria di RNA.
2. PCR invertita(PCR inversa) - utilizzata quando è nota solo una piccola regione all'interno della sequenza desiderata. Questo metodo è particolarmente utile quando si tratta di determinare le sequenze vicine dopo che il DNA è stato inserito nel genoma.
3. La PCR annidata viene utilizzata per ridurre il numero di sottoprodotti della reazione. Vengono utilizzate due coppie di primer e vengono eseguite due reazioni sequenziali.
4. PCR asimmetrica(Inglese: PCR asimmetrica) - viene effettuato quando è necessario amplificare prevalentemente uno dei filamenti del DNA originale. Utilizzato in alcune tecniche di analisi di sequenziamento e ibridazione.
5. PCR quantitativa(PCR quantitativa, Q-PCR (inglese)) o PCR in tempo reale - utilizzato per monitorare direttamente la misurazione della quantità di un prodotto PCR specifico in ciascun ciclo di reazione.
6. Stepdown PCR (Touchdown PCR): utilizzando questo approccio, l'influenza del legame non specifico dei primer viene ridotta.
7. PCR specifica del gruppo(Ing. PCR gruppo-specifico) - PCR per sequenze correlate all'interno della stessa o tra specie diverse, utilizzando primer conservativi per queste sequenze.

Se la sequenza nucleotidica dello stampo è parzialmente nota o sconosciuta del tutto, è possibile utilizzare primer degenerati, la cui sequenza contiene posizioni degenerate in cui può essere localizzata qualsiasi base. Ad esempio, la sequenza dei primer potrebbe essere: ...ATH..., dove H è A, T o C.

Quali materiali biologici vengono studiati?

Vari terreni biologici e fluidi umani possono servire come materiale per la ricerca PCR, in cui è possibile rilevare DNA batterico estraneo o DNA o RNA virale:

1. Urina. Può essere utilizzato per le infezioni del tratto genito-urinario negli uomini e degli organi urinari nelle donne (negli uomini, l'uso dell'urina come materiale sostituisce il raschiamento epiteliale).
2. Espettorato. Viene utilizzato per diagnosticare la tubercolosi e, meno comunemente, per diagnosticare le forme respiratorie di clamidia e micoplasmosi. L'espettorato in una quantità di 15-20 ml viene raccolto in un flacone sterile (monouso).
3. Fluidi biologici. Succo prostatico, liquido pleurico, spinale, amniotico, liquido articolare, lavaggio broncoalveolare, saliva vengono raccolti secondo le indicazioni.
4. Raschiamenti epiteliali dalle mucose. Tipicamente utilizzato per diagnosticare malattie sessualmente trasmissibili (MST), come gonorrea, clamidia, micoplasmosi, ureaplasmosi, tricomoniasi, gardnerellosi, herpes e altre infezioni che colpiscono le mucose.
5. Biopsie. Le biopsie gastriche più comunemente utilizzate sono duodeno per rilevare l’infezione da Helicobacter pylori.
6. Sangue, plasma, siero. Utilizzato per l'analisi PCR dei virus dell'epatite B, C, D, G, herpes, CMV, HIV e per la ricerca sui geni umani.

Come prepararsi al test?

L'affidabilità del risultato della PCR dipende direttamente dalla correttezza del materiale sottoposto all'esame. Il materiale non deve essere contaminato, altrimenti il ​​risultato dello studio non sarà obiettivo. Le raccomandazioni più importanti prima di eseguire un test PCR includono i seguenti requisiti:

1. L'urina viene raccolta al mattino in un contenitore sterile.
2. Un esame del sangue per le infezioni deve essere eseguito a stomaco vuoto al mattino.
3. Non dovresti essere sessualmente attivo il giorno prima del test.

Il risultato dell'analisi sarà pronto 1,5-2 giorni dopo la procedura in questione. Ci sono situazioni in cui il risultato può essere preparato lo stesso giorno.

Decodifica dell'analisi OPC

Il processo di interpretazione della ricerca presentata si distingue per la sua semplicità. I risultati dell'analisi PCR possono essere ottenuti 1,5-2 giorni dopo l'invio del materiale. In alcuni casi, il risultato è pronto il primo giorno ed ecco cosa possono significare:

• Risultato negativo dimostra che il materiale diagnostico non contiene l'agente infettivo desiderato.
• PCR positivo significa che il DNA o l'RNA dell'agente patogeno è presente nel corpo umano.

In alcuni casi, i microrganismi vengono quantificati. Ciò è particolarmente vero per le malattie causate da microrganismi opportunisti. Poiché questi batteri manifestano i loro effetti negativi solo in quantità eccessive.

Inoltre, l'analisi quantitativa della PCR è importante per la scelta delle tattiche terapeutiche e allo scopo di monitorarne il trattamento infezione virale come i virus dell’HIV e dell’epatite.

Quanto è accurata la diagnosi PCR delle infezioni?

Il metodo PCR è caratterizzato da elevata accuratezza, specificità e sensibilità. Significa che questa analisi capace di:

• determinare con precisione la presenza o l'assenza di infezione;
• indicare esattamente di che tipo di infezione si tratta (specificità);
• rilevare l'infezione anche con un contenuto di DNA microbico molto basso nel materiale biologico,
• che è stato testato (sensibilità).

Analisi PCR: prezzo e condizioni

Il prezzo di un test specifico dipenderà dal tipo di infezione per cui verrai sottoposto al test. Prezzi e condizioni approssimativi:

1. STI: 300-500 rubli, termini – 1 giorno;
2. Virus Epstein-Barr, papillomavirus umano, herpes, citomegalovirus: 300-500 rubli, termini - 1 giorno;
3. Epatite A, B, C, D, G: analisi qualitativa 650 rubli, analisi quantitativa 2000 rubli. Termini – fino a 5 giorni;
4. Anticorpi contro il virus dell'epatite C, totale (Anti-HCV) – 420 rubli;
5. Anticorpi contro il virus dell'epatite C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 rubli;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubli, termini – 1 giorno;
7. HIV (anticorpi e antigeni) – 380 rubli;
8. HIV RNA, alta qualità – 3.500 rubli;
9. HIV RNA, quantitativamente – 11.000 rubli.

Per risparmiare denaro, puoi scegliere un pacchetto di analisi fisso. Questo servizio è fornito dalla maggior parte delle cliniche in cui è possibile sottoporsi al test utilizzando il metodo PRC (invitro, onclinic, ecc.).

La reazione a catena della polimerasi (PCR, PCR - reazione a catena della polimerasi) è un metodo per ottenere copie multiple di determinati frammenti di DNA (geni) in un campione biologico.

L'essenza della PCR come metodo di biologia molecolare è la ripetuta copia selettiva di un gene specifico (una sezione del DNA) utilizzando enzimi speciali in condizioni in vitro. Una caratteristica importante della PCR è la produzione di copie di una specifica sezione di DNA (gene) che soddisfa condizioni specifiche. Un sinonimo del processo di copia del DNA è “amplificazione”. replicazione del DNA in vivo può anche essere considerata un'amplificazione. Tuttavia, a differenza della replicazione, il processo di reazione a catena della polimerasi amplifica brevi sezioni di DNA (massimo 40.000 paia di basi).

Principi di base

Quindi, la PCR è la copia ripetuta di alcuni frammenti di DNA in vitro durante cicli ripetuti di temperatura. Come avviene il processo di reazione all'interno di un ciclo di temperatura?

La formazione della catena nucleotidica viene effettuata dall'enzima DNA polimerasi. Tuttavia, per iniziare a funzionare, l’enzima ha bisogno di una rampa di lancio. Le piattaforme sono "primer" (seminatrici): oligonucleotidi sintetici lunghi 15-20 nucleotidi. Devono esserci due primer (avanti e indietro), sono complementari alle sezioni del modello di DNA, ed è il frammento di DNA limitato dai primer che verrà copiato molte volte dalla DNA polimerasi. Il lavoro della polimerasi è quello di aggiungere sequenzialmente nucleotidi complementari alla sequenza del modello di DNA. Pertanto, in un ciclo di temperatura, vengono nuovamente sintetizzati due nuovi frammenti di DNA (poiché la molecola di DNA è a doppio filamento, inizialmente ci sono due matrici). Pertanto, in 25-35 cicli, nella provetta si accumulano miliardi di copie della regione del DNA determinata dai primer. La struttura di un ciclo separato può essere rappresentata come segue:

1. Denaturazione del DNA (fusione, divergenza delle catene del DNA) - 95°C - 1 o 2 minuti;
2. ricottura dei primer (i primer si legano allo stampo di DNA, la temperatura di questa fase è determinata dalla composizione nucleotidica del primer) - 60°C (ad esempio) - 1 minuto;
3. Allungamento del DNA (la polimerasi sintetizza una catena di DNA) - 72°C - 1 minuto (il tempo dipende dalla lunghezza del frammento sintetizzato).

La strumentazione per l'utilizzo del metodo della reazione a catena della polimerasi in laboratorio dovrebbe essere costituita da:

1. (o, come viene anche chiamato, termociclatore);
2. sistemi per s (per la visualizzazione dei risultati della PCR);
3. sistemi (per analizzare i risultati della PCR);
4. (per la preparazione del campione);
5. set (meccanico o elettronico).

Oltre all'attrezzatura principale e ausiliaria per il pieno funzionamento del laboratorio PCR, sono necessari alcuni materiali di consumo: puntali sterili, provette, rack per provette e dispensatori.

La base del reagente in un laboratorio PCR convenzionale per l'esecuzione di una vera e propria reazione a catena della polimerasi comprende l'enzima DNA polimerasi con un tampone, primer (piccoli frammenti di DNA sintetico complementari all'inizio e alla fine della sezione analizzata del modello di DNA), un miscela di nucleotidi (A, T, G, C). Anche l'acqua purificata è assolutamente necessaria.

Vantaggi del metodo PCR

Alta sensibilità dello studio

La sensibilità del metodo è tale che è possibile amplificare mediante PCR e identificare la sequenza bersaglio anche se è presente una sola volta in un campione di 10 5 cellule.

Specificità del test

La PCR consente di rilevare il DNA di uno specifico agente infettivo in presenza del DNA di altri microrganismi e del DNA dell'organismo ospite, nonché di effettuare la genotipizzazione. Selezionando in modo specifico i componenti della reazione (primer), è possibile rilevare contemporaneamente il DNA di microrganismi strettamente correlati.

La versatilità del metodo PCR

Il fatto è che per la diagnostica PCR di malattie infettive o malattie umane ereditarie è possibile utilizzare la stessa attrezzatura, seguire procedure universali per la preparazione e l'analisi dei campioni, nonché lo stesso tipo di kit di reagenti.

Risparmia tempo

Un vantaggio importante della PCR è l'assenza di fasi del lavoro microbiologico culturale. La preparazione dei campioni, le prestazioni della reazione e l'analisi dei risultati sono semplificate e ampiamente automatizzate. Grazie a ciò il tempo per ottenere i risultati può essere ridotto a 4-5 ore.

Efficienza del metodo PCR

Ampiezza del materiale clinico studiato

Non solo il materiale biologico di un paziente può essere utilizzato come campione in una reazione a catena della polimerasi, ma anche molti altri substrati in cui le molecole di DNA possono essere identificate con elevata sensibilità, ad esempio acqua, suolo, cibo, microrganismi, tamponi e molto altro .

Tutti i vantaggi sopra menzionati di questo metodo unico - elevata sensibilità e specificità, identificazione di un agente infettivo e genotipizzazione di qualsiasi gene umano, alta efficienza e risparmio di tempo, versatilità della base dello strumento - consentono oggi al metodo PCR di essere ampiamente utilizzato in ambito clinico. diagnostica, pratica medica, ricerca scientifica, controllo qualità e molte altre aree.

Applicazione della PCR

I campi di applicazione della reazione a catena della polimerasi come metodo moderno di biologia molecolare sono molteplici. Ciò è dovuto in gran parte all'ampiezza del materiale che può essere analizzato (quasi tutto ciò da cui è possibile isolare DNA più o meno di alta qualità può diventare oggetto di ricerca), nonché ai primer selezionati. Principali aree di applicazione della PCR:

medicina Clinica

• diagnosi di malattie infettive
• diagnosi di malattie ereditarie
• rilevamento di mutazioni
• genotipizzazione
• tecnologie cellulari
• creazione di passaporti genetici

ecologia

• monitoraggio ambientale
• analisi degli alimenti
• analisi di organismi geneticamente modificati (OGM)

medicina legale e criminologia

• identificazione personale
• accertamento della paternità

farmacologia

medicina Veterinaria

ricerca scientifica (biologia molecolare, genetica)

Organizzazione di un laboratorio di PCR

Informazioni sull'ordine

Nome	Volume	Produzione	Metodo	Cat.No.

1. Reazione a catena della polimerasi (PCR)

2. Il principio del metodo della reazione a catena della polimerasi

2.1 La presenza di un numero di componenti nella miscela di reazione

2.2 Regime ciclico di temperatura

2.3 Principi di base per la scelta dei primer

2.4 Effetto plateau

3. Fasi della PCR

3.2 Amplificazione

3.4.1 Controlli positivi

3.4.2 Controlli interni

4.1 Analisi qualitativa

4.1.2 Rilevazione di molecole di RNA

3.1 Preparazione di un campione biologico

Per isolare il DNA, vengono utilizzate varie tecniche a seconda delle attività da svolgere. La loro essenza sta nell'estrazione (estrazione) del DNA da una preparazione biologica e nella rimozione o neutralizzazione delle impurità estranee per ottenere una preparazione del DNA con una purezza adatta alla PCR.

Il metodo descritto da Marmur per ottenere una preparazione di DNA puro è considerato standard ed è già diventato classico. Comprende la proteolisi enzimatica seguita dalla deproteinizzazione e dalla riprecipitazione del DNA con alcol. Questo metodo consente di ottenere una preparazione di DNA puro. Tuttavia, è piuttosto laborioso e implica lavorare con persone così aggressive e Odore forte sostanze come fenolo e cloroformio.

Uno dei metodi attualmente popolari è il metodo di estrazione del DNA proposto da Boom et al. Questo metodo si basa sull'utilizzo di un forte agente caotropico, la guanidina tiocianato (GuSCN), per la lisi cellulare e il successivo assorbimento del DNA su un supporto (sfere di vetro, farina fossile, vetro di latte, ecc.). Dopo il lavaggio, il DNA rimane nel campione, adsorbito sul carrier, dal quale può essere facilmente rimosso utilizzando un tampone di eluizione. Il metodo è conveniente, tecnologicamente avanzato e adatto per preparare un campione per l'amplificazione. Tuttavia, la perdita di DNA è possibile a causa dell'assorbimento irreversibile sul trasportatore, nonché durante numerosi lavaggi. Ciò è particolarmente importante quando si lavora con piccole quantità di DNA in un campione. Inoltre, anche tracce di GuSCN possono inibire la PCR. Pertanto, quando si utilizza questo metodo, è molto importante la scelta corretta del assorbente e l'attenta aderenza alle sfumature tecnologiche.

Un altro gruppo di metodi di preparazione dei campioni si basa sull'uso di scambiatori ionici di tipo Chilex che, a differenza del vetro, non assorbono il DNA, ma piuttosto le impurità che interferiscono con la reazione. Di norma, questa tecnologia comprende due fasi: ebollizione del campione e assorbimento delle impurità su uno scambiatore di ioni. Il metodo è estremamente interessante per la sua semplicità di esecuzione. Nella maggior parte dei casi è adatto per lavorare con materiale clinico. Sfortunatamente, a volte ci sono campioni con impurità che non possono essere rimosse utilizzando scambiatori di ioni. Inoltre, alcuni microrganismi non possono essere distrutti mediante la semplice bollitura. In questi casi è necessario introdurre fasi aggiuntive di elaborazione del campione.

Pertanto, la scelta del metodo di preparazione del campione dovrebbe essere presa in considerazione con la comprensione degli scopi dell'analisi prevista.

3.2 Amplificazione

Per effettuare la reazione di amplificazione è necessario preparare una miscela di reazione e addizionarvi il campione di DNA analizzato. È importante tenere conto di alcune caratteristiche della ricottura del primer. Il fatto è che, di regola, il campione biologico analizzato contiene varie molecole di DNA, con le quali i primer utilizzati nella reazione hanno un'omologia parziale, e in alcuni casi significativa. Inoltre, i primer possono ricotturarsi tra loro, formando dimeri di primer. Entrambi portano ad un consumo significativo di primer per la sintesi dei sottoprodotti (non specifici) dei prodotti di reazione e, di conseguenza, riducono significativamente la sensibilità del sistema. Ciò rende difficile o impossibile leggere i risultati della reazione durante l'elettroforesi.

3.3 Valutazione dei risultati della reazione

Per valutare correttamente i risultati della PCR, è importante capirlo questo metodo non è quantitativo. Teoricamente, i prodotti di amplificazione di singole molecole di DNA bersaglio possono essere rilevati mediante elettroforesi dopo 30-35 cicli. Tuttavia, in pratica, ciò avviene solo nei casi in cui la reazione avviene in condizioni prossime all'ideale, cosa che non accade spesso nella vita. Il grado di purezza della preparazione del DNA ha un'influenza particolarmente grande sull'efficienza dell'amplificazione, vale a dire la presenza nella miscela di reazione di alcuni inibitori, che in alcuni casi possono essere estremamente difficili da eliminare. A volte, a causa della loro presenza, anche decine di migliaia di molecole di DNA bersaglio non possono essere amplificate. Pertanto, spesso non esiste una relazione diretta tra la quantità iniziale di DNA target e la quantità finale di prodotti di amplificazione.

3.3.1 Metodo dell'elettroforesi orizzontale

Vengono utilizzati vari metodi per visualizzare i risultati dell'amplificazione. Il metodo più comune oggi è l'elettroforesi, basata sulla separazione delle molecole di DNA per dimensione. Per fare ciò, preparare una piastra di gel di agarosio, che viene solidificato dopo lo scioglimento in un tampone di elettroforesi ad una concentrazione dell'1,5-2,5% con l'aggiunta di uno speciale colorante per DNA, ad esempio il bromuro di etidio. L'agarosio solidificato forma un reticolo spaziale. Quando si versa mediante pettini, nel gel si formano appositi pozzetti, nei quali vengono successivamente aggiunti i prodotti di amplificazione. La piastra di gel viene posizionata in un apparecchio per elettroforesi su gel orizzontale e viene collegata una sorgente di tensione costante. Il DNA carico negativamente inizia a muoversi nel gel dal meno al più. In questo caso, le molecole di DNA più corte si muovono più velocemente di quelle più lunghe. La velocità di movimento del DNA nel gel è influenzata dalla concentrazione di agarosio, dall'intensità del campo elettrico, dalla temperatura, dalla composizione del tampone dell'elettroforesi e, in misura minore, dalla composizione GC del DNA. Tutte le molecole della stessa dimensione si muovono alla stessa velocità. Il colorante è incorporato (intercalato) da gruppi planari nelle molecole di DNA. Dopo il completamento dell'elettroforesi, che dura da 10 minuti a 1 ora, il gel viene posto su un filtro transilluminatore che emette luce nella gamma degli ultravioletti (254 - 310 nm). L'energia ultravioletta assorbita dal DNA a 260 nm viene trasferita al colorante, provocandone la fluorescenza nella regione rosso-arancione dello spettro visibile (590 nm).

La luminosità delle bande del prodotto di amplificazione può variare. Tuttavia, ciò non può essere correlato alla quantità iniziale di DNA target presente nel campione.

3.3.2 Metodo dell'elettroforesi verticale

Il metodo dell'elettroforesi verticale è fondamentalmente simile all'elettroforesi orizzontale. La loro differenza è quella in in questo caso Al posto dell'agarosio vengono utilizzati gel di poliacrilammide. Viene effettuato in una camera speciale per l'elettroforesi verticale. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide ha una risoluzione maggiore rispetto all'elettroforesi di agarosio e consente di distinguere molecole di DNA di diverse dimensioni con una precisione di un nucleotide. La preparazione del gel di poliacrilammide è leggermente più complicata rispetto al gel di agarosio. Inoltre, l'acrilammide lo è sostanza tossica. Poiché raramente si presenta la necessità di determinare la dimensione del prodotto di amplificazione con una precisione di 1 nucleotide, nel lavoro di routine viene utilizzato il metodo dell'elettroforesi orizzontale.

3.4 Monitoraggio dell'andamento della reazione di amplificazione

3.4.1 Controlli positivi

Come “controllo positivo” viene utilizzata una preparazione del DNA del microrganismo desiderato. Gli ampliconi non specifici differiscono per dimensioni dagli ampliconi formatisi come risultato dell'amplificazione con una preparazione di DNA di controllo. I prodotti non specifici possono avere dimensioni maggiori o minori rispetto al controllo positivo. Nel peggiore dei casi, queste dimensioni possono coincidere e vengono lette come positive nell'elettroforesi.

Per controllare la specificità del prodotto di amplificazione risultante, è possibile utilizzare sonde di ibridazione (sezioni di DNA situate all'interno della sequenza amplificata), marcate con tag enzimatici o isotopi radioattivi e interagenti con il DNA secondo gli stessi principi dei primer. Ciò complica e allunga notevolmente l'analisi e il suo costo aumenta in modo significativo.

3.4.2 Controlli interni

È necessario monitorare l'avanzamento dell'amplificazione in ciascuna provetta con la miscela di reazione. A questo scopo viene utilizzato un ulteriore cosiddetto “controllo interno”. È qualsiasi preparazione del DNA che è dissimile dal DNA del microrganismo desiderato. Se alla miscela di reazione viene aggiunto un controllo interno, questo diventerà lo stesso bersaglio per la ricottura dei primer del DNA cromosomico dell'agente infettivo desiderato. La dimensione del prodotto di amplificazione del controllo interno viene selezionata in modo che sia 2 o più volte più grande degli ampliconi formati dall'amplificazione del DNA del microrganismo desiderato. Di conseguenza, se il DNA del controllo interno viene aggiunto alla miscela di reazione insieme al campione da testare, indipendentemente dalla presenza di un microrganismo nel campione biologico, il controllo interno causerà la formazione di ampliconi specifici, ma significativamente più lunghi (più pesanti) rispetto all'amplicone del microrganismo. La presenza di ampliconi pesanti nella miscela di reazione indicherà il normale andamento della reazione di amplificazione e l'assenza di inibitori. Se non si formano ampliconi della dimensione richiesta, ma non si formano nemmeno ampliconi di controllo interno, possiamo concludere che nel campione analizzato sono presenti impurità indesiderate che dovrebbero essere eliminate, ma non dell'assenza del DNA desiderato.

Sfortunatamente, nonostante tutta l’attrattiva di questo approccio, presenta un difetto significativo. Se nella miscela di reazione è presente il DNA desiderato, l'efficienza della sua amplificazione diminuisce drasticamente a causa della competizione con il controllo interno per i primer. Ciò è particolarmente importante in caso di basse concentrazioni di DNA nel campione del test, che possono portare a risultati falsi negativi.

Tuttavia, a condizione che venga risolto il problema della competizione per i primer, questo metodo di monitoraggio dell'efficienza di amplificazione sarà sicuramente molto utile.

4. Metodi basati sulla reazione a catena della polimerasi

4.1 Analisi qualitativa

Il metodo classico di esecuzione della PCR, i cui principi sono stati delineati sopra, è stato sviluppato in alcune modifiche volte a superare i limiti della PCR e ad aumentare l'efficienza della reazione.

4.1.1 Metodo per eseguire la PCR utilizzando un “hot start”

Per ridurre il rischio di formazione di prodotti di reazione di amplificazione aspecifici, viene utilizzato un approccio chiamato “Hot-start” la cui essenza è quella di impedire l'inizio della reazione fino a quando nella provetta non vengono raggiunte le condizioni che garantiscono la ricottura specifica dei primer.

Il fatto è che, a seconda della composizione e delle dimensioni del GC, i primer hanno una certa temperatura di fusione (Tm). Se la temperatura del sistema supera la Tm, il primer non è in grado di aderire al filamento di DNA e si denatura. Soggetto a condizioni ottimali, ad es. Con una temperatura di ricottura prossima alla temperatura di fusione, il primer forma una molecola a doppio filamento solo se è completamente complementare e garantisce così la specificità della reazione.

Esistono diverse possibilità per implementare un “hot start”:

Aggiunta della Taq polimerasi alla miscela di reazione durante il primo ciclo dopo aver riscaldato la provetta alla temperatura di denaturazione.

Separazione degli ingredienti della miscela di reazione mediante uno strato di paraffina in strati (nella parte inferiore - primer, nella parte superiore - Taq polimerasi e DNA target), che vengono miscelati quando la paraffina si scioglie (~ 65-75 0 C).

Utilizzo di anticorpi monoclonali anti-Taq polimerasi. L'enzima legato dagli anticorpi monoclonali diventa attivo solo dopo la prima fase di denaturazione, quando gli anticorpi monoclonali vengono denaturati in modo irreversibile e rilasciano i siti attivi della Taq polimerasi.

In tutti i casi sopra menzionati, anche se si è verificata una ricottura non specifica prima dell'inizio del ciclo di temperatura, non si verifica allungamento e, durante il riscaldamento, i complessi primer-DNA vengono denaturati, quindi non si formano prodotti non specifici. Successivamente, la temperatura nella provetta non scende al di sotto della temperatura di fusione, il che garantisce la formazione di un prodotto di amplificazione specifico.

4.1.2 Rilevazione di molecole di RNA

La possibilità di utilizzare l'RNA come bersaglio per la PCR amplia significativamente la gamma di applicazioni di questo metodo. Ad esempio, i genomi di molti virus (epatite C, virus dell'influenza, picornavirus, ecc.) sono rappresentati da RNA. Inoltre nei loro cicli vitali non esiste una fase intermedia di trasformazione in DNA. Per rilevare l'RNA, deve prima essere convertito in forma di DNA. Per fare questo viene utilizzata la trascrittasi inversa, che viene isolata da due diversi virus: il virus della mieloblastosi aviaria e il virus della leucemia murina Moloney. L'uso di questi enzimi è associato ad alcune difficoltà. Innanzitutto sono termolabili e quindi possono essere utilizzati a temperature non superiori a 42° C. Poiché a questa temperatura le molecole di RNA formano facilmente strutture secondarie, l'efficienza della reazione diminuisce notevolmente e, secondo varie stime, è pari a circa il 5%. Si sta tentando di aggirare questo inconveniente utilizzando una polimerasi termostabile ottenuta dal microrganismo termofilo Thermus Thermophilus, che presenta attività di trascrittasi in presenza di Mn 2+ , come trascrittasi inversa. È l'unico enzima conosciuto in grado di esibire sia l'attività della polimerasi che quella della trascrittasi.

Per eseguire una reazione di trascrizione inversa, la miscela di reazione, proprio come nella PCR, deve contenere primer come primer e una miscela di 4 dNTP come materiale da costruzione.

Dopo aver eseguito una reazione di trascrizione inversa, le molecole di cDNA risultanti possono fungere da bersaglio per la PCR

5. Organizzazione del processo tecnologico di esecuzione della PCR

La sensibilità potenzialmente elevata della reazione a catena della polimerasi rende assolutamente necessaria una progettazione particolarmente attenta del laboratorio PCR. Ciò è dovuto al problema più acuto del metodo: la contaminazione.

La contaminazione è l'ingresso dall'ambiente esterno nella miscela di reazione di specifiche molecole di DNA che possono fungere da bersagli nella reazione di amplificazione e fornire risultati falsi positivi.

Esistono diversi modi per combattere questo spiacevole fenomeno. Uno di questi è l’uso dell’enzima N-uracile glicosilasi (UG). Questo metodo si basa sulla capacità dell'UG di scindere le molecole di DNA con uracile incorporato. La reazione di amplificazione viene eseguita utilizzando una miscela di dNTP in cui il dTTP è sostituito da uracile e, dopo il ciclo termico, tutti gli ampliconi formati nella provetta conterranno uracile. Se si aggiunge CG alla miscela di reazione prima dell'amplificazione, gli ampliconi che entrano nella miscela di reazione verranno distrutti, mentre il DNA nativo rimarrà intatto e successivamente fungerà da bersaglio per l'amplificazione.

Pertanto, questo metodo elimina solo in una certa misura la fonte di contaminazione e non garantisce contro risultati falsi positivi.

Un altro modo per combattere gli effetti della contaminazione è ridurre significativamente il numero di cicli di reazione (fino a 25-30 cicli). Ma anche con questo approccio il rischio di ottenere risultati falsi positivi è elevato, poiché in questo caso, in assenza di inibitori, è facile ottenere un prodotto di amplificazione a causa della contaminazione.

Pertanto, nonostante i vantaggi delle misure di preamplificazione volte a inattivare le molecole di DNA che causano risultati falsi positivi, il rimedio più radicale è un’organizzazione di laboratorio ben ponderata.

Conclusione

Il metodo PCR è attualmente ampiamente utilizzato come metodo per diagnosticare varie malattie infettive. La PCR consente di identificare l'eziologia di un'infezione anche se il campione prelevato per l'analisi contiene solo poche molecole di DNA dell'agente patogeno. La PCR è ampiamente utilizzata nella diagnosi precoce delle infezioni da HIV, dell’epatite virale, ecc. Oggi non esiste quasi nessun agente infettivo che non possa essere rilevato utilizzando la PCR.