Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος υψηλής ακρίβειας για την ανίχνευση συγκεκριμένων μολυσματικών παραγόντων. Ανάλυση PCR - τι είναι: πώς και πού να δωρίσετε Primers για PCR

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)- πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας, η οποία είναι μια ειδική ενίσχυση νουκλεϊκών οξέων που προκαλείται από συνθετικούς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές in vitro.

Η ιδέα της ανάπτυξης της μεθόδου PCR ανήκει στον Αμερικανό ερευνητή Kary Mullis, ο οποίος το 1983 δημιούργησε μια μέθοδο που κατέστησε δυνατή την ενίσχυση του DNA κατά τους κυκλικούς διπλασιασμούς χρησιμοποιώντας το ένζυμο DNA πολυμεράση σε τεχνητές συνθήκες. Λίγα χρόνια μετά τη δημοσίευση αυτής της ιδέας, το 1993, ο K. Mullis έλαβε το Νόμπελ γι' αυτήν.

Στην αρχή της χρήσης της μεθόδου, μετά από κάθε κύκλο θέρμανσης-ψύξης, ήταν απαραίτητο να προστεθεί DNA πολυμεράση στο μείγμα της αντίδρασης, καθώς απενεργοποιήθηκε γρήγορα σε υψηλή θερμοκρασία. Η διαδικασία ήταν πολύ αναποτελεσματική, απαιτούσε πολύ χρόνο και ένζυμα. Το 1986, τροποποιήθηκε σημαντικά με τη χρήση πολυμεράσης DNA από θερμόφιλα βακτήρια. Αυτά τα ένζυμα είναι σε θέση να αντέξουν πολλούς κύκλους αντίδρασης, γεγονός που σας επιτρέπει να αυτοματοποιήσετε την PCR. Μία από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες θερμοσταθερές πολυμεράσες DNA έχει απομονωθεί από βακτήρια. Thermus aquaticusκαι ονομάστηκε Taq-DNA πολυμεράση.

Η ουσία της μεθόδου.Η μέθοδος βασίζεται σε πολλαπλή επιλεκτική αντιγραφή μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Taq-DNA πολυμεράση. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης καθιστά δυνατή τη λήψη ενισχυτών μήκους έως και αρκετών χιλιάδων ζευγών βάσεων. Για να αυξηθεί το μήκος του προϊόντος PCR σε 20-40 χιλιάδες ζεύγη βάσεων, χρησιμοποιείται ένα μείγμα διαφόρων πολυμερασών, αλλά εξακολουθεί να είναι πολύ μικρότερο από το μήκος του χρωμοσωμικού DNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου.

Η αντίδραση πραγματοποιείται σε έναν προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή) - μια συσκευή που μπορεί να εκτελέσει αρκετά γρήγορα

ψύξη και θέρμανση δοκιμαστικών σωλήνων (συνήθως με ακρίβεια τουλάχιστον 0,1 °C). Οι ενισχυτές σάς επιτρέπουν να ορίσετε πολύπλοκα προγράμματα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με τη δυνατότητα "hot start" και επακόλουθης αποθήκευσης. Για PCR σε πραγματικό χρόνο, παράγονται συσκευές εξοπλισμένες με ανιχνευτή φθορισμού. Τα όργανα είναι επίσης διαθέσιμα με αυτόματο καπάκι και διαμέρισμα μικροπλάκας, επιτρέποντάς τους να ενσωματωθούν σε αυτοματοποιημένα συστήματα.

Συνήθως, κατά τη διάρκεια της PCR, εκτελούνται 20-45 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από τρία στάδια: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητών, επιμήκυνση (Εικ. 6.1 και 6.2). Στο σχ. Το 6.1 δείχνει τη δυναμική των αλλαγών θερμοκρασίας στον δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια του κύκλου PCR.

Ρύζι. 6.1.Γράφημα της μεταβολής της θερμοκρασίας στον δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια ενός κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

μετουσίωση προτύπου DNAπραγματοποιείται με θέρμανση του μίγματος της αντίδρασης στους 94-96 ° C για 5-90 δευτερόλεπτα έτσι ώστε οι αλυσίδες DNA να διασπαρούν. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι πριν από τον πρώτο κύκλο, το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2-5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως η αρχική μήτρα, γεγονός που καθιστά δυνατή τη μείωση της ποσότητας των μη ειδικών προϊόντων αντίδρασης.

Ρύζι. 6.2.Σχήμα του πρώτου κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Στάδιο ανόπτησης ασταριού.Με σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας, τα αστάρια συνδέονται συμπληρωματικά με το εκμαγείο. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τη σύνθεση των ασταριών και είναι συνήθως 4-5°C χαμηλότερη από την υπολογιζόμενη θερμοκρασία τήξης. Η διάρκεια της σκηνής είναι 5-60 δευτερόλεπτα.

Στο επόμενο στάδιο - επιμήκυνση- υπάρχει μια σύνθεση του θυγατρικού κλώνου του DNA στη μητρική μήτρα. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι κοινώς χρησιμοποιούμενες πολυμεράσες Taq και Pfu DNA είναι πιο δραστικές στους 72°C. Ο χρόνος επιμήκυνσης, που εξαρτάται κυρίως από το μήκος του προϊόντος PCR, είναι τυπικά 1 λεπτό ανά 1000 ζεύγη βάσεων.

SEI HPE "Κρατική Ιατρική Ακαδημία Krasnoyarsk

πήρε το όνομά του από τον Yasenetsky ομοσπονδιακή υπηρεσίαγια την Υγεία και την Κοινωνική Ανάπτυξη »

Τμήμα Ιατρικής Γενετικής και Κλινικής Νευροφυσιολογίας, IPO

ΚΥΡΙΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Μεθοδικό εγχειρίδιο για μαθητές 3-4 μαθημάτων

στις ειδικότητες γενικής ιατρικής (060101) και

Krasnoyarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Βασικές αρχές της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Μεθοδολογικό εγχειρίδιο εξωσχολικής εργασίας σπουδαστών 3-4 μαθημάτων των ειδικοτήτων γενικής ιατρικής (060101) και παιδιατρικής (060103). - Krasnoyarsk: Εκδοτικός οίκος GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42σ.

Το εγχειρίδιο συμμορφώνεται πλήρως με τις απαιτήσεις του κρατικού προτύπου (2000) και αντικατοπτρίζει τις κύριες πτυχές της σύγχρονης μεθόδου για τη διάγνωση κληρονομικών ανθρώπινων ασθενειών - τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, το εκπαιδευτικό υλικό είναι προσαρμοσμένο εκπαιδευτικές τεχνολογίεςλαμβάνοντας υπόψη τις ιδιαιτερότητες της εκπαίδευσης σε 3-4 μαθήματα ιατρικών και παιδιατρικών σχολών.

Αξιολογητές:Προϊστάμενος του Τμήματος Ιατρικής Γενετικής, Κρατικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Ανώτατης Επαγγελματικής Εκπαίδευσης

"Κρατικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Νοβοσιμπίρσκ της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Υγείας και Κοινωνικής Ανάπτυξης", Διδάκτωρ Ιατρικών Επιστημών, Καθηγητής.

Αντιγραφή DNA

Αντικείμενο μελέτης αυτής της μεθόδου είναι το Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA). Το DNA είναι ένας παγκόσμιος φορέας γενετικής πληροφορίας σε όλους τους οργανισμούς που υπάρχουν στη Γη (με εξαίρεση τους μικροοργανισμούς που περιέχουν RNA). Το DNA είναι ένας διπλός κλώνος στριμμένος σε έλικα. Κάθε κλώνος αποτελείται από νουκλεοτίδια συνδεδεμένα σε σειρά. Οι κλώνοι DNA έχουν την αντίθετη κατεύθυνση: το 5'-άκρο ενός κλώνου αντιστοιχεί στο 3'-άκρο του δεύτερου κλώνου. Η μοναδική ιδιότητα του DNA είναι η ικανότητά του να διπλασιάζεται. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αντιγραφή. Η αντιγραφή του μορίου του DNA λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της συνθετικής περιόδου της ενδιάμεσης φάσης. Κάθε μία από τις δύο αλυσίδες του «γονικού» μορίου χρησιμεύει ως πρότυπο για την «κόρη». Μετά την αντιγραφή, το νεοσυντιθέμενο μόριο DNA περιέχει έναν "μητρικό" κλώνο και το δεύτερο - μια "κόρη", που έχει πρόσφατα συντεθεί (ημι-συντηρητική μέθοδος). Για τη σύνθεση εκμαγείου ενός νέου μορίου DNA, είναι απαραίτητο το παλιό μόριο να απελευθερωθεί και να τεντωθεί. Ο αναδιπλασιασμός ξεκινά σε διάφορες θέσεις στο μόριο του DNA. Η τομή ενός μορίου DNA από την αρχή μιας αντιγραφής έως την έναρξη μιας άλλης ονομάζεται αντίγραφο.

Η έναρξη της αναπαραγωγής είναι ενεργοποιημένη αστάρια(σπόροι), που αποτελούνται από 100-200 ζεύγη βάσεων. Το ένζυμο ελικάση DNA ξετυλίγει και διαχωρίζει τη μητρική έλικα DNA σε δύο κλώνους, πάνω στους οποίους, σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας, με τη συμμετοχή του ενζύμου DNA πολυμεράσης, συναρμολογούνται «θυγατρικές» κλώνοι DNA. Προκειμένου το ένζυμο να ξεκινήσει τη δουλειά του, απαιτείται η παρουσία ενός μπλοκ εκκίνησης - ένα μικρό αρχικό δίκλωνο θραύσμα. Το αρχικό μπλοκ σχηματίζεται όταν ο εκκινητής αλληλεπιδρά με τη συμπληρωματική περιοχή του αντίστοιχου κλώνου του μητρικού DNA. Σε κάθε ρεπλικόνιο, η DNA πολυμεράση μπορεί να κινηθεί κατά μήκος του «μητρικού» κλώνου προς μία μόνο κατεύθυνση (5`=>3`).

Στο κύριο σκέλος, καθώς το ρεπλικόνιο ξετυλίγεται, ένας κλώνος "κόρη" σταδιακά μεγαλώνει συνεχώς. Στο υστερούμενο σκέλος, το θυγατρικό σκέλος συντίθεται επίσης προς την κατεύθυνση (5`=>3`), αλλά σε ξεχωριστά θραύσματα καθώς το ρεπλικόνιο ξετυλίγεται.

Έτσι, η προσκόλληση των συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων των «θυγατρικών» κλώνων πηγαίνει σε αντίθετες κατευθύνσεις (αντιπαράλληλη). Η αναπαραγωγή σε όλα τα αντίγραφα πραγματοποιείται ταυτόχρονα. Θραύσματα και μέρη "θυγατρικών" κλώνων που συντίθενται σε διαφορετικά αντίγραφα συνδέονται σε έναν μόνο κλώνο από μια ενζυμική λιγάση. Η αντιγραφή χαρακτηρίζεται από ημι-συντήρηση, αντιπαραλληλισμό και ασυνέχεια. Ολόκληρο το γονιδίωμα ενός κυττάρου αντιγράφεται μία φορά ανά χρονική περίοδο που αντιστοιχεί σε έναν μιτωτικό κύκλο. Ως αποτέλεσμα της διαδικασίας αντιγραφής, δύο μόρια DNA σχηματίζονται από ένα μόριο DNA, στο οποίο ο ένας κλώνος είναι από το μητρικό μόριο DNA και ο δεύτερος, το θυγατρικό, συντίθεται πρόσφατα (Εικ. 1).

Ρύζι. ένας. Διάγραμμα αντιγραφής μορίου DNA.

Έτσι, ο κύκλος αντιγραφής του DNA περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια:

1. ξετύλιγμα της έλικας του DNA και απόκλιση κλώνων (μετουσίωσης).

2. προσάρτηση ασταριών.

3. συμπλήρωση της αλυσίδας του παιδικού νήματος.

Αρχή της μεθόδου PCR

Ήταν η αντιγραφή του DNA που αποτέλεσε τη βάση της PCR. Στην PCR, οι διαδικασίες που αναφέρονται παραπάνω πραγματοποιούνται σε δοκιμαστικό σωλήνα σε κυκλικό τρόπο. Η μετάβαση από το ένα στάδιο της αντίδρασης στο άλλο επιτυγχάνεται με αλλαγή της θερμοκρασίας του μίγματος επώασης. Όταν το διάλυμα θερμαίνεται στους 93-95°C, λαμβάνει χώρα μετουσίωση του DNA. Για να προχωρήσετε στο επόμενο βήμα - την προσθήκη ή "ανόπτηση" των εκκινητών - το μίγμα επώασης ψύχεται στους 50-65°C. Στη συνέχεια, το μείγμα θερμαίνεται στους 70-72°C - η βέλτιστη λειτουργία της πολυμεράσης taq-DNA - σε αυτό το στάδιο, ολοκληρώνεται ένας νέος κλώνος DNA. Στη συνέχεια ο κύκλος επαναλαμβάνεται ξανά. Με άλλα λόγια Η μέθοδος PCR είναι μια πολλαπλή αύξηση του αριθμού των αντιγράφων (ενίσχυση) ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA που καταλύεται από το ένζυμο DNA πολυμεράση.

Η επέκταση των θυγατρικών κλώνων DNA πρέπει να συμβεί ταυτόχρονα και στους δύο κλώνους του μητρικού DNA, επομένως η αντιγραφή του δεύτερου κλώνου απαιτεί επίσης το δικό του εκκινητή. Έτσι, δύο εκκινητές εισάγονται στο μίγμα αντίδρασης: ένας για την "+"-αλυσίδα, ο δεύτερος για την "-"-αλυσίδα. Έχοντας ενώσει τους αντίθετους κλώνους του μορίου DNA, οι εκκινητές περιορίζονται σε αυτό το τμήμα του, το οποίο στη συνέχεια θα διπλασιαστεί ή θα ενισχυθεί επανειλημμένα. Το μήκος ενός τέτοιου θραύσματος, το οποίο ονομάζεται αμπλικόνιο, είναι συνήθως αρκετές εκατοντάδες νουκλεοτίδια.

Βήματα PCR

Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλαμβάνει 3 στάδια που συμβαίνουν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας (Εικ. 2).

· Στάδιο 1:Μετουσίωσης DNA . Ρέει στις 93-95° για 30-40 δευτερόλεπτα.

· Στάδιο 2:ανόπτηση ασταριού . Η προσκόλληση εκκινητή λαμβάνει χώρα συμπληρωματικά προς τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε αντίθετους κλώνους DNA στα όρια μιας συγκεκριμένης θέσης. Κάθε ζεύγος ασταριών έχει τη δική του θερμοκρασία ανόπτησης, οι τιμές της οποίας είναι στην περιοχή 50-65°C. Χρόνος ανόπτησης 20-60 sec.

· Στάδιο 3:επέκταση των αλυσίδων DNA Συμπληρωματική επέκταση των αλυσίδων DNA εμφανίζεται από το άκρο 5" έως το άκρο 3" της αλυσίδας σε αντίθετες κατευθύνσεις, ξεκινώντας από τις θέσεις προσάρτησης του εκκινητή. Το υλικό για τη σύνθεση νέων κλώνων DNA είναι τριφωσφορικοί δεοξυριβονουκλεοζίτες που προστίθενται στο διάλυμα. Η διαδικασία σύνθεσης καταλύεται από το ένζυμο taq-πολυμεράση και λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία 70-72°C. Χρόνος σύνθεσης - 20-40 sec.

Οι νέοι κλώνοι DNA που σχηματίστηκαν στον πρώτο κύκλο ενίσχυσης χρησιμεύουν ως μήτρες για τον δεύτερο κύκλο ενίσχυσης, στον οποίο σχηματίζεται ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA αμπλικονίου (Εικ. 3). Στους επόμενους κύκλους ενίσχυσης, τα αμπλικόνια χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων αλυσίδων.

Έτσι, υπάρχει μια συσσώρευση αμπλικονίων σε ένα διάλυμα σύμφωνα με τον τύπο 2", όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης. Επομένως, ακόμη και αν μόνο ένα μόριο δίκλωνου DNA ήταν αρχικά στο αρχικό διάλυμα, τότε περίπου 108 μόρια αμπλικονίου συσσωρεύονται στο διάλυμα σε κύκλους 30-40. Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για αξιόπιστη οπτική ανίχνευση αυτού του θραύσματος με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.

Η διαδικασία ενίσχυσης πραγματοποιείται σε ειδικό προγραμματιζόμενο θερμοστάτη ( ποδηλάτης), το οποίο, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες ανάλογα με τον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης.

Τα ακόλουθα στοιχεία απαιτούνται για την ενίσχυση:

· Πρότυπο DNA(DNA ή τμήμα του που περιέχει το επιθυμητό ειδικό θραύσμα).

· Primers(συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (20-30 ζεύγη νουκλεοτιδίων) συμπληρωματικά σε αλληλουχίες DNA στα όρια του συγκεκριμένου θραύσματος που προσδιορίζεται). Η επιλογή ενός συγκεκριμένου θραύσματος και η επιλογή εκκινητών παίζουν σημαντικό ρόλο στην ειδικότητα της ενίσχυσης, η οποία επηρεάζει την ποιότητα της ανάλυσης.

· Ένα μείγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs)(ένα μείγμα τεσσάρων dNTP, τα οποία αποτελούν το υλικό για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων DNA σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις 200-500 microns)

· ΕνζυμοTaq- πολυμεράση(θερμοσταθερή πολυμεράση DNA, που καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων εκκινητών με διαδοχική προσθήκη νουκλεοτιδικών βάσεων στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα του συντιθέμενου DNA, 2-3 mm).

· ρυθμιστικό διάλυμα(μέσο αντίδρασης που περιέχει ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη διατήρηση της ενζυμικής δραστηριότητας, PH 6,8-7,8).

Για να προσδιοριστούν συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος των ιών RNA, ένα αντίγραφο DNA λαμβάνεται πρώτα από ένα πρότυπο RNA χρησιμοποιώντας μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) που καταλύεται από το ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (αντίστροφη μεταγραφάση).

Ρύζι. 2. Ενίσχυση (1ος κύκλος).

Ρύζι. 3. Ενίσχυση (2ος κύκλος).

Κύριες εφαρμογές της PCR

κλινικό φάρμακο:

o διάγνωση λοιμώξεων,

o εντοπισμός μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένης της διάγνωσης κληρονομικών ασθενειών,

o προσδιορισμός γονότυπου, συμπεριλαμβανομένου του γονότυπου HLA,

o κυψελοειδείς τεχνολογίες

οικολογία (ως τρόπος παρακολούθησης της κατάστασης και της ποιότητας των περιβαλλοντικών αντικειμένων και των τροφίμων)

ορισμός των διαγονιδιακών οργανισμών (ΓΤΟ)

Προσωπική ταυτοποίηση, πατρότητα, ιατροδικαστική

γενική και ειδική βιολογία,

Βασικές αρχές

οργάνωση διαγνωστικών εργαστηρίων

Οι εργασίες στο εργαστήριο PCR πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους "Κανόνες για το σχεδιασμό, την ασφάλεια, τη βιομηχανική υγιεινή, το αντιεπιδημικό καθεστώς και την προσωπική υγιεινή κατά την εργασία σε εργαστήρια (τμήματα, τμήματα) υγειονομικών και επιδημιολογικών ιδρυμάτων του συστήματος υγειονομικής περίθαλψης.

Μόλυνση δειγμάτων DNA

Η διεξαγωγή διαγνωστικών PCR σχετίζεται με πρόβλημα που προκαλείται από την υψηλή ευαισθησία της μεθόδου - η δυνατότητα μόλυνση. Η εισαγωγή ιχνοποσοτήτων θετικού DNA στο σωληνάριο αντίδρασης (ειδικά προϊόντα ενίσχυσης DNA - αμπλικόνια, πρότυπο DNA που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας, θετικό DNA κλινικού δείγματος) οδηγεί σε ενίσχυση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA κατά τη διάρκεια της PCR και, ως αποτέλεσμα , στην εμφάνιση ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Κατά τη διάρκεια της εργασίας, μπορεί να συναντήσετε δύο είδη μόλυνσης:

1. διασταυρούμενη μόλυνσηαπό δείγμα σε δείγμα (κατά την επεξεργασία κλινικών δειγμάτων ή κατά την εκσκαφή του μείγματος αντίδρασης), που οδηγεί στην εμφάνιση σποραδικών ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

2. επιμόλυνση προϊόντος ενίσχυσης(amplicons) που έχουν υψηλότερη τιμή, γιατί κατά τη διαδικασία της PCR, τα αμπλικόνια συσσωρεύονται σε τεράστιες ποσότητες και είναι ιδανικά προϊόντα για επανενίσχυση.

Η ίχνη μόλυνσης πιάτων, αυτόματων πιπέτων και εργαστηριακού εξοπλισμού με αμπλικόνη, η επιφάνεια των εργαστηριακών τραπεζιών ή ακόμα και η επιφάνεια του δέρματος των εργαζομένων στο εργαστήριο οδηγεί στην εμφάνιση συστηματικών ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ο προσδιορισμός της πηγής μόλυνσης μπορεί να είναι πολύ δύσκολος και απαιτεί σημαντική επένδυση χρόνου και χρήματος. Η εμπειρία που έχει συσσωρευτεί μέχρι σήμερα στις εργασίες των εργαστηρίων με τη χρήση της μεθόδου PCR για τη διάγνωση μας επιτρέπει να διαμορφώσουμε τις βασικές απαιτήσεις για την οργάνωση τέτοιων εργαστηρίων και τη διεξαγωγή των ίδιων των αναλύσεων. Η συμμόρφωση με αυτές τις απαιτήσεις εξαλείφει την πιθανότητα μόλυνσης και λήψης ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Στάδια ανάλυσης PCR

Γεωγραφικά διαχωρισμένα, τοποθετώντας τα σε ξεχωριστά δωμάτια (Εικ. 4.5):

· Αίθουσα Pre-PCR,όπου πραγματοποιείται επεξεργασία κλινικών δειγμάτων, εκχύλιση DNA, προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης για PCR και PCR (εάν υπάρχουν διαθέσιμες συνθήκες, τα δύο τελευταία βήματα συνιστάται επίσης να πραγματοποιηθούν σε επιπλέον ξεχωριστό δωμάτιο). Σε αυτούς τους χώρους απαγορεύεται η διεξαγωγή όλων των άλλων τύπων εργασιών με τους μελετηθέντες παράγοντες, η διάγνωση PCR των οποίων διενεργείται σε αυτό το εργαστήριο.

· Αίθουσα μετά την PCR,όπου πραγματοποιείται η ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης. Σε αυτό το δωμάτιο μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες μέθοδοι ανίχνευσης. Είναι επιθυμητό να εντοπιστεί ο χώρος για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης όσο το δυνατόν πιο μακριά από τα δωμάτια προ-PCR.

Οι αίθουσες εργασίας είναι εξοπλισμένες με λαμπτήρες υπεριώδους με μέγιστη ακτινοβολία στην περιοχή των 260 nm (τύπου DB-60) με ρυθμό 2,5 W ανά 1 m3. Οι λαμπτήρες τοποθετούνται έτσι ώστε οι επιφάνειες των τραπεζιών εργασίας, ο εξοπλισμός και τα υλικά με τα οποία έρχεται σε επαφή ο χειριστής κατά την ανάλυση PCR να εκτίθενται σε άμεση ακτινοβολία. Η ακτινοβόληση πραγματοποιείται εντός 1 ώρας πριν από την έναρξη της εργασίας και εντός 1 ώρας μετά το τέλος της εργασίας.

Οι εργαστηριακοί γιατροί εργάζονται με ειδικά εργαστηριακά ρούχα, τα οποία αλλάζουν όταν μετακινούνται από το ένα δωμάτιο στο άλλο, και με γάντια μιας χρήσης. Η επεξεργασία ρούχων από διαφορετικά δωμάτια πραγματοποιείται χωριστά. Διαφορετικοί υπάλληλοι εργάζονται σε διαφορετικά στάδια της ανάλυσης PCR.

Για εργασία, χρησιμοποιούνται ξεχωριστά σετ διανομέων, πλαστικών και γυαλικών, εργαστηριακού εξοπλισμού, ρόμπες και γάντια, σχεδιασμένα για διάφορα στάδια ανάλυσης και μη φορητά από το ένα δωμάτιο στο άλλο. Ο εξοπλισμός, τα υλικά και το απόθεμα σε κάθε δωμάτιο επισημαίνονται ανάλογα.

Όλα τα στάδια της εργασίας εκτελούνται μόνο με τη χρήση αναλώσιμων μιας χρήσης: άκρες για αυτόματες πιπέτες, δοκιμαστικούς σωλήνες, γάντια κ.λπ. Φροντίστε να αλλάζετε τις άκρες όταν μετακινείστε από δείγμα σε δείγμα. Είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε άκρες με φίλτρο φραγμού αερολύματος για να αποτρέψετε την είσοδο μικροσταγονιδίων του διαλύματος στην πιπέτα. Οι χρησιμοποιημένοι δοκιμαστικοί σωλήνες και τα άκρα απορρίπτονται σε ειδικά δοχεία ή δοχεία που περιέχουν απολυμαντικό διάλυμα. Τα κλινικά δείγματα αποθηκεύονται χωριστά από τα αντιδραστήρια.

Για την επεξεργασία και τον καθαρισμό του χώρου εργασίας, κάθε δωμάτιο διαθέτει μπατονέτες-γάζας (πετσέτες), τσιμπιδάκια, απολυμαντικά και διαλύματα αδρανοποίησης.

Στο διαγνωστικό εργαστήριο PCR, οι εργασίες που σχετίζονται με την παραγωγή (κλωνοποίηση) και την απομόνωση ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που περιέχουν αλληλουχίες DNA ή θραύσματα γονιδίων παθογόνων που διαγιγνώσκονται σε αυτό το εργαστήριο αποκλείονται.

Συλλογή κλινικού υλικού

Το υλικό που μελετήθηκε για την PCR μπορεί να είναι αποξέσεις επιθηλιακών κυττάρων, αίματος, πλάσματος, ορού, υπεζωκοτικού και εγκεφαλονωτιαίου υγρού, ούρων, πτυέλων, βλέννας και άλλων βιολογικών εκκρίσεων, δείγματα βιοψίας.

Η δειγματοληψία του υλικού πραγματοποιείται στις συνθήκες του θαλάμου θεραπείας του αντίστοιχου προφίλ. Μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα θα πρέπει να μεταφερθούν στο διαγνωστικό εργαστήριο PCR το συντομότερο δυνατό.

Η δειγματοληψία πρέπει να πραγματοποιείται με αποστειρωμένα όργανα, κατά προτίμηση μιας χρήσης, μόνο σε αποστειρωμένους πλαστικούς σωλήνες μιας χρήσης ή γυάλινους σωλήνες, προεπεξεργασμένους για μία ώρα με μείγμα χρωμίου, πλυμένο καλά με απεσταγμένο νερό και φρύξη σε φούρνο σε θερμοκρασία 150 ° C για 1 ώρα.

Ζώνη ανίχνευσης (άλλος όροφος ή άλλο κτίριο).

Ρύζι. τέσσερις. Εργαστηριακή συσκευή PCR με ανίχνευση με ηλεκτροφόρηση.

Ζώνη ανίχνευσης (διαφορετικός όροφος ή κτίριο)

Ρύζι. 5. Εργαστηριακή συσκευή PCR με ανίχνευση φθορισμού (ποσοτική ανάλυση).

Ρύζι. 6. Αίθουσα εξαγωγής DNA.Εμφανίζεται ένα επιτραπέζιο κουτί με βακτηριοκτόνο λαμπτήρα.

Ρύζι. 7. αίθουσα ενίσχυσης.

Ρύζι. οκτώ. Αίθουσα ανίχνευσης.

Ρύζι. 9. Δείγματα αίματος για διάγνωση DNA κληρονομικών ασθενειών.

Αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων

Για τη διάγνωση των κληρονομικών ασθενειών, τα δείγματα αίματος αποθηκεύονται σε ειδικές χάρτινες φόρμες ή σε epindorf (πλαστικοί δοκιμαστικοί σωλήνες) σε παγωμένη κατάσταση για μεγάλο χρονικό διάστημα (Εικ. 9).

Για διαγνωστικά μεταδοτικές ασθένειεςΤα δείγματα βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου για όχι περισσότερο από 2 ώρες. Εάν απαιτείται μεγαλύτερη αποθήκευση, τα δείγματα μπορούν να τοποθετηθούν σε ψυγείο σε θερμοκρασία 2-8°C για περίοδο που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες. Η μεγαλύτερη αποθήκευση (έως 2 εβδομάδες) είναι αποδεκτή όταν καταψύχεται σε κατάψυξη σε θερμοκρασία μείον 20°C. Δεν επιτρέπεται η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη-απόψυξη των δειγμάτων.

Εάν το διαγνωστικό εργαστήριο PCR και η αίθουσα διαδικασιών για τη δειγματοληψία είναι χωρισμένα εδαφικά, τότε τα δείγματα θα πρέπει να μεταφέρονται σε θερμοδοχεία ή θερμικά δοχεία σύμφωνα με τους κανόνες αποθήκευσης δειγμάτων και τους κανόνες μεταφοράς μολυσματικών υλικών.

Εξαγωγή DNA από δείγματα

Η μέθοδος προσρόφησης στερεάς φάσης, η οποία συνίσταται στην προσθήκη ενός παράγοντα λύσης που περιέχει διάλυμα γουανιδίνης, ρόφηση DNA σε ροφητή, επαναλαμβανόμενη πλύση και επαναρρόφηση του DNA με ρυθμιστικό διάλυμα, έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη. Στην περίπτωση επεξεργασίας ορού, πλάσματος ή πλήρους αίματος, συνήθως χρησιμοποιείται η μέθοδος της εκχύλισης με φαινόλη. Η μέθοδος περιλαμβάνει αποπρωτεϊνοποίηση με φαινόλη/χλωροφόρμιο ακολουθούμενη από καθίζηση DNA (ή RNA) με αιθανόλη ή ισοπροπανόλη. Η επεξεργασία πραγματοποιείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες μικροφυγοκέντρησης τύπου Eppendor P με όγκο 1,5 ml. Ο χρόνος επεξεργασίας είναι 1,5-2 ώρες (Εικ. 10).

Ρύζι. δέκα. Απομόνωση DNA.

Διεξαγωγή PCR

Ορισμένη ποσότητα δείγματος από το επεξεργασμένο κλινικό δείγμα μεταφέρεται σε ειδικό σωλήνα μικροφυγόκεντρου τύπου Eppendorf με όγκο 0,2 ή 0,5 ml. Ένα μείγμα ενίσχυσης που αποτελείται από νερό, ρυθμιστικό PCR, διάλυμα dNTP, διάλυμα εκκινητή και διάλυμα προστίθεται στο Το ίδιο σωληνάριο Taq-πολυμεράση (προστέθηκε τελευταία στο μείγμα) Τυπικά, ο όγκος του μείγματος αντίδρασης είναι 25 μl Στη συνέχεια προστίθεται μία σταγόνα ορυκτέλαιο σε κάθε σωλήνα για να αποτραπεί η εξάτμιση του μίγματος της αντίδρασης κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. Οι σωλήνες μεταφέρονται σε έναν προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή), όπου η ενίσχυση πραγματοποιείται σε αυτόματη λειτουργία σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα (Εικ. 11).

Ρύζι. έντεκα. Ενισχυτής " Θερμοκυκλωτής ».

Ο χρόνος αντίδρασης, ανάλογα με το δεδομένο πρόγραμμα, είναι 2-3 ώρες. Παράλληλα με τα πειραματικά δείγματα τοποθετούνται δείγματα ελέγχου: ο θετικός μάρτυρας περιλαμβάνει όλα τα συστατικά της αντίδρασης, αλλά αντί για το υλικό του κλινικού δείγματος εισάγεται ένα παρασκεύασμα DNA ελέγχου του υπό μελέτη γονιδίου. Ο αρνητικός έλεγχος περιλαμβάνει όλα τα συστατικά της αντίδρασης, αλλά αντί για το κλινικό υλικό ή το παρασκεύασμα DNA, προστίθεται κατάλληλη ποσότητα απιονισμένου νερού ή εκχυλίσματος που δεν περιέχει το μελετημένο DNA. Απαιτείται αρνητικός έλεγχος για τον έλεγχο των συστατικών της αντίδρασης για απουσία DNA σε αυτά λόγω μόλυνσης και για τον αποκλεισμό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Καταχώρηση αποτελεσμάτων

Το ενισχυμένο ειδικό θραύσμα DNA ανιχνεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. Το βρωμιούχο αιθίδιο σχηματίζει μια σταθερή ενδιάμεση ένωση με θραύσματα DNA, η οποία εμφανίζεται ως φωτεινές ζώνες όταν το πήκτωμα ακτινοβολείται με ακτινοβολία UV με μήκος κύματος 290-330 nm. Ανάλογα με το μέγεθος των αμπλικονίων PCR που προκύπτουν, χρησιμοποιείται ένα πήκτωμα που περιέχει 1,5% έως 2,5% αγαρόζη. Για να παρασκευαστεί ένα πήκτωμα αγαρόζης, ένα μείγμα αγαρόζης, ρυθμιστικού διαλύματος και νερού τήκεται σε φούρνο μικροκυμάτων ή σε λουτρό νερού και προστίθεται ένα διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου. Ψύχεται στους 50-60°C, το μείγμα χύνεται στο καλούπι με ένα στρώμα πάχους 4-6 mm και χρησιμοποιώντας ειδικές χτένες, φτιάχνονται τσέπες στο πήκτωμα για την εφαρμογή του δείγματος. Οι χτένες τοποθετούνται έτσι ώστε μεταξύ του πυθμένα των φρεατίων και της βάσης της γέλης να παραμένει ένα στρώμα αγαρόζης 0,5-1 mm. Αφού σκληρύνει το πήκτωμα, εφαρμόζεται ενίσχυση στους θύλακες σε ποσότητα 5-15 μl. Συνιστάται η διεξαγωγή ηλεκτροφόρησης ενός μείγματος δεικτών μήκους θραυσμάτων DNA παράλληλα με δείγματα ελέγχου και πειραματικά. Τυπικά, ένα τέτοιο μίγμα περιέχει δέκα θραύσματα DNA 100, 200, 300, κ.λπ. μακρών ζευγών βάσεων.

Η ρύθμιση ενός τέτοιου δείγματος σάς επιτρέπει να επαληθεύσετε το μήκος των αμπλικονίων στα δείγματα ελέγχου και στα πειραματικά δείγματα. Το πήκτωμα με το εφαρμοσμένο δείγμα μεταφέρεται σε θάλαμο ηλεκτροφόρησης γεμάτο με ρυθμιστικό διάλυμα, ο θάλαμος συνδέεται με πηγή ισχύος και ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των προϊόντων ενίσχυσης πραγματοποιείται για 30-45 λεπτά σε ένταση ηλεκτρικού πεδίου 10-15 V/cm. Σε αυτή την περίπτωση, το μπροστινό μέρος της βαφής, που αποτελεί μέρος του μείγματος αντίδρασης, πρέπει να περάσει τουλάχιστον 3 cm.

Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα μεταφέρεται στο γυαλί του transilluminator και παρατηρείται στο υπεριώδες φως. Για τεκμηρίωση, η γέλη φωτογραφίζεται σε φιλμ Mikrat 300 ή εγγράφεται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βίντεο συνδεδεμένο σε υπολογιστή.

Τα δείγματα ελέγχου αξιολογούνται πρώτα. Στην ηλεκτροφορητική λωρίδα που αντιστοιχεί στον θετικό μάρτυρα, θα πρέπει να υπάρχει μια πορτοκαλί φωτεινή ταινία. Η ηλεκτροφορητική του κινητικότητα θα πρέπει να αντιστοιχεί στο μήκος του ενισχυτικού που καθορίζεται στις οδηγίες.

Στην ηλεκτροφορητική τροχιά που αντιστοιχεί στον αρνητικό έλεγχο, μια τέτοια ζώνη θα πρέπει να απουσιάζει. Η παρουσία μιας τέτοιας ζώνης στον αρνητικό έλεγχο υποδηλώνει μόλυνση - μόλυνση των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται με το μελετημένο DNA ή το αμπλικόνιο. Τα δείγματα δοκιμής αξιολογούνται με την παρουσία στην αντίστοιχη λωρίδα μιας ζώνης που βρίσκεται στο ίδιο επίπεδο με τη ζώνη στο δείγμα θετικού μάρτυρα. Η ένταση της λάμψης της ζώνης αντιστοιχεί στην ποσότητα του υπό μελέτη DNA στο δείγμα, γεγονός που επιτρέπει μια ημιποσοτική αξιολόγηση της PCR. Συνήθως θετικά αποτελέσματααξιολογούνται σε κλίμακα τεσσάρων βαθμών. Εάν η λάμψη της ζώνης στο πειραματικό δείγμα είναι πολύ ασθενής, τότε ένα τέτοιο δείγμα θα πρέπει να αναδιαταχθεί (Εικ. 12).

Ρύζι. 12. Ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης.

Εφαρμογές PCR γιαδιάγνωση σημειακών μεταλλάξεων και γονιδιακών πολυμορφισμών

Ένας από τους κορυφαίους τομείς εφαρμογής της PCR στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη είναι η διάγνωση σημειακών μεταλλάξεων και γονιδιακών πολυμορφισμών. . Υπάρχουν άμεσες και έμμεσες μέθοδοι διάγνωσης DNA. Σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου είναι γνωστό ένα γονίδιο, η βλάβη του οποίου οδηγεί στην ανάπτυξη μιας κληρονομικής ασθένειας, αυτή η βλάβη μπορεί να ανιχνευθεί με μοριακές γενετικές μεθόδους. Τέτοιες μέθοδοι ονομάζονται άμεσες. Χρησιμοποιώντας άμεσες μεθόδους, ανιχνεύονται διαταραχές στην πρωτογενή νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA (μεταλλάξεις και οι τύποι τους). Οι άμεσες μέθοδοι χαρακτηρίζονται από ακρίβεια που φτάνει σχεδόν το 100%.

Ωστόσο, στην πράξη, αυτές οι μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν υπό ορισμένες προϋποθέσεις.:

με γνωστό κυτταρογενετικό εντοπισμό του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για την ανάπτυξη μιας κληρονομικής νόσου.

Το γονίδιο της νόσου πρέπει να κλωνοποιηθεί και να είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία.

Ο στόχος της άμεσης διάγνωσης DNA είναι ο εντοπισμός μεταλλαγμένων αλληλόμορφων.

Έτσι, σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου είναι γνωστό τι είδους βλάβη στο DNA οδηγεί σε μια κληρονομική ασθένεια, το θραύσμα DNA που περιέχει τη βλάβη εξετάζεται απευθείας, δηλαδή χρησιμοποιείται η άμεση μέθοδος διάγνωσης του DNA.

Ωστόσο, μέχρι σήμερα, τα γονίδια πολλών ασθενειών δεν έχουν χαρτογραφηθεί, η οργάνωση εξωνίου-ιντρονίου τους είναι άγνωστη και πολλές κληρονομικές ασθένειες χαρακτηρίζονται από έντονη γενετική ετερογένεια, η οποία δεν επιτρέπει την πλήρη χρήση άμεσων διαγνωστικών μεθόδων DNA. Επομένως, σε περιπτώσεις όπου ο εντοπισμός της βλάβης δεν είναι γνωστός, χρησιμοποιείται μια διαφορετική προσέγγιση, που σχετίζεται με τη μελέτη της γειτνίασης του γονιδίου που ευθύνεται για τη γονιδιακή νόσο, σε συνδυασμό με οικογενειακή ανάλυση, δηλαδή έμμεσες μεθόδους μοριακής γενετικής διάγνωσης. κληρονομικών ασθενειών χρησιμοποιούνται.

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες μέθοδοι για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και μικρών διαγραφών, αλλά όλες βασίζονται στη χρήση της μεθόδου PCR. Αυτή η αντίδραση σάς επιτρέπει να πολλαπλασιάσετε επανειλημμένα την αλληλουχία νουκλεοτιδίων του DNA και στη συνέχεια να αναζητήσετε μεταλλάξεις. Οι μέθοδοι αναζήτησης για θραύσματα DNA που φέρουν μεταλλάξεις βασίζονται σε μια συγκριτική ανάλυση μεταλλαγμένων και φυσιολογικών αλληλουχιών νουκλεοτιδίων DNA.

Ανάλυση προϊόντων PCR

στη διαδικασία της άμεσης διάγνωσης του DNA

Περιλαμβάνει τη μελέτη συγκεκριμένων χαρακτηριστικών της ενισχυμένης περιοχής του γονιδίου. Έτσι, σε ασθένειες που προκαλούνται από την επέκταση των επαναλήψεων τρινουκλεοτιδίων, τα προϊόντα ενίσχυσης διαφέρουν ως προς το μήκος τους (αντανακλώντας διαφορετικό αριθμό τριδύμων στην περιοχή του γονιδίου που μελετήθηκε) και, ως αποτέλεσμα, στην ταχύτητα κίνησής τους στο πήκτωμα. Λόγω αυτού, επιτυγχάνεται σαφής ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλόμορφων και ακριβής προσδιορισμός του παθολογικά επιμηκυμένου θραύσματος, δηλαδή διάγνωση DNA της νόσου (Εικ. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ρύζι. δεκατέσσερα. Διάγνωση διαγραφής ΦΙΜΩΤΡΟ στο γονίδιο DYT 1 σε ασθενείς με δυστονία ανεξάρτητη από τη ντόπα (ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου). Κομμάτια 2,3,6 - άρρωστος. λωρίδες 1,4,5 - έλεγχος. Το λεπτό βέλος υποδεικνύει το κανονικό αλληλόμορφο, το έντονο βέλος δείχνει το μεταλλαγμένο βραχύτερο αλληλόμορφο (διαγραφή τριών νουκλεοτιδίων).

Εάν η υπό μελέτη περιοχή DNA περιλαμβάνεται εξ ολοκλήρου σε μια εκτεταμένη διαγραφή, τότε η ενίσχυση PCR του DNA από αυτό το διαγραμμένο αλληλόμορφο δεν θα πραγματοποιηθεί λόγω της έλλειψης θέσεων για υβριδισμό εκκινητών. Σε αυτή την περίπτωση, θα διαγνωστεί μια ομόζυγη διαγραφή με βάση την πλήρη απουσία του προϊόντος PCR της αντίδρασης (η σύνθεση DNA είναι αδύνατη και από τα δύο αντίγραφα του γονιδίου). Με μια ετερόζυγη διαγραφή, είναι δυνατό να ανιχνευθεί ένα προϊόν PCR που συντίθεται από ένα φυσιολογικό (ασφαλές) αλληλόμορφο, ωστόσο, για αξιόπιστη διάγνωση μιας τέτοιας μετάλλαξης, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν πιο εξελιγμένες μέθοδοι οπτικοποίησης DNA που επιτρέπουν την εκτίμηση της δόσης του τελικού Προϊόν PCR.

Για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων (τις περισσότερες φορές υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων) σε ορισμένες θέσεις, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους μοριακής γενετικής ανάλυσης. Εάν η θέση και η φύση της προτεινόμενης σημειακής μετάλλαξης είναι επακριβώς γνωστά, τότε για τη σκόπιμη ανίχνευση μιας τέτοιας μετάλλαξης, περιοριστικές ενδονουκλεάσες (περιορισμούς) είναι ειδικά κυτταρικά ένζυμα που απομονώνονται από διάφορα στελέχη βακτηρίων.

Αυτά τα ένζυμα αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που κυμαίνονται από τέσσερα έως δέκα νουκλεοτίδια σε μήκος. Στη συνέχεια πραγματοποιούν τον περιορισμό (λατ. (κοπή) αυτών των αλληλουχιών ως μέρος ενός μορίου δίκλωνου DNA. Κάθε περιοριστικό ένζυμο αναγνωρίζει και κόβει σε ένα σταθερό μέρος μια αυστηρά καθορισμένη, ειδική αλληλουχία νουκλεοτιδίων - τοποθεσία περιορισμού (τόπος αναγνώρισης).

Σε περιπτώσεις όπου μια σημειακή μετάλλαξη αλλάζει τη φυσική θέση αναγνώρισης για ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού, αυτό το ένζυμο δεν θα μπορεί να διασπάσει το μεταλλαγμένο ενισχυμένο με PCR θραύσμα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η μετάλλαξη οδηγεί στην εμφάνιση μιας νέας θέσης αναγνώρισης για ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού, το οποίο απουσιάζει στον κανόνα.

Και στις δύο περιπτώσεις, τα μεταλλαγμένα και κανονικά προϊόντα PCR που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το επιλεγμένο ένζυμο περιορισμού θα δώσουν περιοριστικά θραύσματα διαφορετικού μήκους, τα οποία μπορούν εύκολα να ανιχνευθούν με ηλεκτροφόρηση (Εικ. 15).

Έτσι, εάν είναι απαραίτητο να ανιχνευθεί γρήγορα οποιαδήποτε συγκεκριμένη σημειακή μετάλλαξη, η εργασία περιορίζεται στην αναζήτηση του αντίστοιχου ενζύμου περιορισμού, η θέση αναγνώρισης του οποίου εντοπίζεται στη θέση της διαταραγμένης αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Η θεραπεία προϊόντων PCR με αυτό το ένζυμο περιορισμού θα επιτρέψει την εύκολη διαφοροποίηση των φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλόμορφων. Η ανάλυση περιορισμού απλοποιεί σημαντικά την ανίχνευση γνωστών σημειακών μεταλλάξεων και σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως για την άμεση διάγνωση DNA κληρονομικών ασθενειών.

τελικό στάδιο μοριακή γενετική ανάλυση μεταλλάξεωνείναι ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του θραύσματος DNA που μελετήθηκε (sequencing), η οποία συγκρίνεται με τον κανόνα και διατυπώνεται η τελική γενετική διάγνωση. Χάρη στην πρόοδο της μοριακής γενετικής, έχουν αναπτυχθεί πλέον διαγνωστικές μέθοδοι DNA για περισσότερες από 400 κληρονομικές ασθένειες.

Ρύζι. δεκαπέντε. Ανίχνευση σημειακής μετάλλαξης χρησιμοποιώντας ανάλυση περιορισμού:Α - ενισχυτή περιοχή του γονιδίου που περιέχει μια θέση περιορισμούAGCTγια περιοριστική ενδονουκλεάσηAlu Εγώ. Μετάλλαξησολ→ ΕΝΑαλλάζει αυτή την αλληλουχία νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα το ένζυμο περιορισμούAluiμπλοκαρισμένο? Β - ηλεκτροφερόγραμμα προϊόντων περιορισμού: λωρίδα 1 - ομοζυγωτία για το κανονικό αλληλόμορφο. λωρίδα 2, ομοζυγωτία για τη μετάλλαξη. λωρίδα 3 - ετερόζυγη κατάσταση (φυσιολογικό αλληλόμορφο + μετάλλαξη).

Η διάγνωση κληρονομικών ασθενειών με βάση την άμεση εξέταση μεταλλαγμένων αλληλόμορφων σε ασθενείς, μέλη της οικογένειάς τους ή εικαζόμενους ετερόζυγους φορείς παθολογικών μεταλλάξεων είναι κατάλληλη για προσυμπτωματική και προγεννητική διάγνωση, η οποία μπορεί να εφαρμοστεί στις περισσότερες πρώιμα στάδιαεμβρυϊκή ανάπτυξη, πριν την εμφάνιση οποιωνδήποτε κλινικών ή βιοχημικών συμπτωμάτων της νόσου.

Ανεξάρτητα από τη μέθοδο ανίχνευσης μεταλλάξεων, ο ακριβής μοριακός χαρακτηρισμός κάθε μετάλλαξης μπορεί να επιτευχθεί μόνο με άμεση αλληλούχιση. Για αυτοματοποίηση αυτής της διαδικασίας σε τα τελευταία χρόνιαΧρησιμοποιούνται ευρέως ειδικές συσκευές - αλληλουχίες, οι οποίες καθιστούν δυνατή τη σημαντική επιτάχυνση της διαδικασίας ανάγνωσης πληροφοριών DNA.

Ο δρόμος για μια ευρύτερη εφαρμογή της μοριακής βιολογικής έρευνας σε κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια ανοίγει με την επιτάχυνση της αναλυτικής διαδικασίας εκτελώντας όλες τις διαδικασίες σε ένα συνεχές, χωρίς μεταφορά δείγματος, δημιουργώντας συνθήκες για την αποφυγή μόλυνσης κατά την παράλληλη δοκιμή ορισμένων αναλυτών και με αντικειμενική καταχώριση των αποτελεσμάτων σε κάθε κύκλο.

Κύριες τροποποιήσεις της μεθόδου PCR

Χρησιμοποιείται για γρήγορη σάρωση και αναζήτηση γνωστών γονιδιακών μεταλλάξεων.

Multiplex (multiprimer) PCR

Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση πολλών εξονίων του μελετημένου γονιδίου σε μία αντίδραση. Αυτό επιτρέπει την οικονομική γρήγορη εξέταση των πιο συχνών μεταλλάξεων. Για παράδειγμα, για τη γρήγορη διάγνωση της μεταφοράς διαγραφών στο γονίδιο της δυστροφίνης σε ασθενείς με προοδευτική μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker, πραγματοποιείται ταυτόχρονη ενίσχυση του συνόλου των πιο συχνά μεταλλαγμένων εξονίων αυτού του γονιδίου. Δεδομένου ότι αυτές οι ασθένειες κληρονομούνται σε έναν υπολειπόμενο τύπο που συνδέεται με Χ και σχετίζονται με βλάβη στο μόνο χρωμόσωμα Χ στα αγόρια, σε περίπτωση εκτεταμένης διαγραφής, η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης θα αποκαλύψει την απουσία ενός ή περισσότερων θραυσμάτων DNA (εξόνια ), το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως μοριακή επιβεβαίωση της διάγνωσης. Επιπλέον, με την επιλογή συγκεκριμένων περιοχών γονιδίου για ενίσχυση PCR, είναι δυνατή μια αρκετά ακριβής εκτίμηση του συνολικού μήκους των σημείων διαγραφής και γονιδιακής θραύσης (μέχρι το εξόνιο).

Η συνδυασμένη χρήση πολλών πολυπλεξικών αντιδράσεων καθιστά δυνατή τη διάγνωση έως και 98% όλων των διαγραφών που συμβαίνουν σε ασθενείς με προοδευτική μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker. Αυτό είναι περίπου το 60% του συνολικού αριθμού των γνωστών μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης και υποδηλώνει μια πολύ υψηλή αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου διαλογής για τη διάγνωση DNA της δυστροφινοπάθειας (Εικ. 16).

Ρύζι. 16. Άμεση διάγνωση DNA της μυϊκής δυστροφίας Duchenne με χρήση multiplex PCR (ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης). Σε καθένα από τα άτομα που εξετάστηκαν, τέσσερα εξόνια του γονιδίου της δυστροφίνης ενισχύθηκαν ταυτόχρονα (εξόνια 17, 19, 44 και 45· τα βέλη δείχνουν τα αντίστοιχα προϊόντα ενίσχυσης). Λωρίδα 1 - έλεγχος, λωρίδες 2-5 - ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne με διάφορες διαγραφές του γονιδίου δυστροφίνης (λωρίδες 2 και 5 - διαγραφή εξονίου 45, λωρίδα 3 - διαγραφή εξονίου 44, λωρίδα 4 - διαγραφή εξονίου 17 και 19 ).

Ειδική για αλληλόμορφη ενίσχυση

Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση δύο ανεξάρτητων ζευγών εκκινητών για μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου: ένας εκκινητής και στα δύο ζεύγη είναι κοινός και ο δεύτερος εκκινητής σε κάθε ζεύγος έχει διαφορετική δομή και είναι συμπληρωματικός είτε με φυσιολογικό είτε με μεταλλαγμένο DNA αλληλουχία. Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας αντίδρασης σε διάλυμα, μπορούν να συντεθούν ταυτόχρονα δύο τύποι προϊόντων PCR - φυσιολογικό και μεταλλαγμένο. Επιπλέον, ο σχεδιασμός των εκκινητών που χρησιμοποιούνται καθιστά δυνατή τη σαφή διαφοροποίηση των κανονικών και μεταλλαγμένων προϊόντων ενίσχυσης με βάση το μοριακό τους μέγεθος. Αυτή η μέθοδος είναι πολύ σαφής και σας επιτρέπει να επαληθεύσετε τόσο την ομο- όσο και την ετερόζυγη μεταφορά του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου.

Μέθοδος για τοποκατευθυνόμενη τροποποίηση του ενισχυμένου DNA

Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση στην PCR του λεγόμενου εκκινητή ασυμφωνίας (όχι πλήρως συμπληρωματικό του εκμαγείου), ο οποίος διαφέρει από την αλληλουχία DNA του εκμαγείου κατά ένα νουκλεοτίδιο. Ως αποτέλεσμα της συμπερίληψης του καθορισμένου εκκινητή στη σύνθεση του μεταλλαγμένου προϊόντος PCR, σχηματίζεται σε αυτό μια τεχνητά δημιουργημένη θέση περιορισμού για μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, η οποία επιτρέπει την άμεση διάγνωση DNA μιας συγκεκριμένης γνωστής μετάλλαξης χρησιμοποιώντας περιοριστική ανάλυση. Η δημιουργία μιας τέτοιας τεχνητής θέσης περιορισμού μπορεί να είναι απαραίτητη εάν η έρευνα δεν αποκάλυψε την ύπαρξη ενός γνωστού και προσβάσιμου ενζύμου, η «φυσική» θέση περιορισμού του οποίου επηρεάζεται ως αποτέλεσμα της εμφάνισης της μελετημένης μετάλλαξης στο μόριο DNA .

Μέθοδος PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (RT- PCR)

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις όπου είναι πιο βολικό να χρησιμοποιηθεί όχι γονιδιωματικό DNA ως αντικείμενο μελέτης, αλλά ένα πιο συμπαγές και πλούσιο σε πληροφορίες cDNA που λαμβάνεται μετά από κατάλληλη επεξεργασία δειγμάτων ιστού, όπως υλικό βιοψίας ή κυτταρικές σειρές λεμφοκυττάρων, ινοβλάστες , κλπ. Σημαντική προϋπόθεση εδώ είναι η έκφραση (τουλάχιστον ελάχιστη) του επιθυμητού γονιδίου στον υπό μελέτη ιστό.

Στο πρώτο στάδιο, πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή του mRNA και τα προκύπτοντα μόρια cDNA χρησιμεύουν ως πρότυπο για PCR. Στη συνέχεια, η κρίσιμη περιοχή cDNA που ενισχύεται σε επαρκή ποσότητα υποβάλλεται σε προσδιορισμό αλληλουχίας και άλλες μεθόδους διαλογής μεταλλάξεων, άμεση ηλεκτροφορητική μελέτη (ανίχνευση διαγραφών, εισαγωγές κ.λπ.) ή ενσωμάτωση σε ένα σύστημα έκφρασης προκειμένου να ληφθεί ένα πρωτεϊνικό προϊόν και η άμεση ανάλυσή του .

Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για την ανίχνευση μεταλλάξεων που οδηγούν στη σύνθεση μιας «κολοβωμένης» πρωτεΐνης (ανόητες μεταλλάξεις, μεταλλάξεις ματίσματος, μεγάλες διαγραφές) - η λεγόμενη ανάλυση PTT (Protein Truncation Test). Η ανάλυση PTT χρησιμοποιείται συνήθως κατά την εξέταση εκτεταμένων γονιδίων πολλαπλών εξονίων, όπως το γονίδιο για μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker, αταξία-τελαγγειεκτασία ή νευροϊνωμάτωση τύπου 1.

PCR σε πραγματικό χρόνο(PCR σε πραγματικό χρόνο)

Κάθε χρόνο, στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη, η PCR σε πραγματικό χρόνο γίνεται μια ολοένα και πιο δημοφιλής διαγνωστική μέθοδος. Το θεμελιώδες χαρακτηριστικό του είναι η παρακολούθηση και η ποσοτική ανάλυση της συσσώρευσης προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και η αυτόματη καταχώρηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αυτή η μέθοδος δεν απαιτεί ένα βήμα ηλεκτροφόρησης, το οποίο μειώνει τις απαιτήσεις για ένα εργαστήριο PCR. Χάρη στην εξοικονόμηση χώρου παραγωγής, τη μείωση του αριθμού προσωπικού και τη ζήτηση για ποσοτικοποίηση DNA/RNA, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται με επιτυχία τα τελευταία χρόνια στα μεγαλύτερα υγειονομικά επιδημικά, διαγνωστικά και ερευνητικά κέντρα στις αναπτυγμένες χώρες του κόσμου. αντικατάσταση της PCR στην τρέχουσα ("κλασική") μορφή της.

Η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιεί φθορίζοντα επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές για την ανίχνευση του DNA κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. Η PCR σε πραγματικό χρόνο επιτρέπει την πλήρη ανάλυση ενός δείγματος εντός 20-60 λεπτών και είναι θεωρητικά ικανή να ανιχνεύσει ακόμη και ένα μόριο DNA ή RNA σε ένα δείγμα.

Ρύζι. 17. PCR σε πραγματικό χρόνο.

Η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιεί το σύστημα TaqMan για τον έλεγχο της κινητικής της PCR απευθείας κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης χρησιμοποιώντας σβέση συντονισμού φθορισμού. Για ανίχνευση, χρησιμοποιείται ένας ανιχνευτής που φέρει ένα φθοροφόρο και έναν αποσβεστήρα συμπληρωματικό στο μεσαίο τμήμα του ενισχυμένου θραύσματος. Όταν το φθοροφόρο και ο αποσβεστήρας συνδέονται με τον ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή, παρατηρείται μόνο μια μικρή ποσότητα φθορίζουσας εκπομπής. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης, λόγω της δραστικότητας 5'-εξωνουκλεάσης της πολυμεράσης Taq, η φθορίζουσα ετικέτα περνά στο διάλυμα, απελευθερώνεται από την περιοχή του αποσβεστήρα και δημιουργεί ένα φθορίζον σήμα που αυξάνεται σε πραγματικό χρόνο ανάλογα με τη συσσώρευση του ενίσχυση (Εικ. 17).

Κύρια πλεονεκτήματα της PCR-Real-Time έναντι της PCR με ηλεκτροφόρηση γέλης:

Η όλη μέθοδος λαμβάνει χώρα σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα.

· Η μέθοδος διαρκεί 1 ώρα.

Αρκετές 1-2 αίθουσες εργασίας.

Μαζί με μια ποιοτική αξιολόγηση του αποτελέσματος, καθίσταται δυνατή η ποσοτικοποίησή του (για παράδειγμα, όταν συνταγογραφείται αντιική θεραπεία για AIDS ή ιογενή ηπατίτιδα, είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε το ιικό φορτίο, δηλαδή την ποσότητα του ιού ανά 1 μονάδα, η οποία παρέχει πραγματική -time PCR);

· Μειώνει δραματικά τον κίνδυνο μόλυνσης.

συμπέρασμα

Η μέθοδος PCR είναι μια από τις πιο κοινές μεθόδους μοριακής βιολογικής έρευνας. Αυτή η μέθοδος θα πρέπει να χρησιμοποιείται με νόημα από τους κλινικούς γιατρούς και ένας γιατρός που αποφασίζει να χρησιμοποιήσει PCR στην εργασία του πρέπει να έχει ορισμένες γνώσεις σχετικά με τα χαρακτηριστικά και τις δυνατότητες αυτής της μεθόδου. Δεύτερον, πρέπει να υπάρχει στενή ανατροφοδότηση μεταξύ του κλινικού ιατρού και του εργαστηρίου PCR, η οποία είναι απαραίτητη για την ανάλυση πολύπλοκων περιπτώσεων και την ανάπτυξη της σωστής διαγνωστικής στρατηγικής. Τρίτον, η ανάλυση PCR δεν αποτελεί πανάκεια στη διάγνωση (κυρίως μολυσματικών ασθενειών) και δεν αντικαθιστά τις υπάρχουσες ερευνητικές μεθόδους, αλλά απλώς τις συμπληρώνει. Και το πιο σημαντικό, η PCR δεν μπορεί να αντικαταστήσει τη διαίσθηση και την αναλυτική σκέψη που πρέπει να έχει ένας γιατρός που προσδοκά επιτυχία.

Π . μικρό . Μοριακές-βιολογικές έρευνες - αλλαγή σημείων αναφοράς διάγνωσης και θεραπείας. Η χρήση μοριακών βιολογικών μεθόδων συνδέεται με την προοπτική μιας ριζικής αλλαγής στην έμφαση στην εργαστηριακή διάγνωση. Μπορούμε να μιλήσουμε όχι μόνο για έγκαιρη ενημέρωση, αλλά για την εκ των προτέρων παραλαβή της. Εάν τώρα οι εργαστηριακές μελέτες στις περισσότερες περιπτώσεις πραγματοποιούνται ήδη με προχωρημένη νόσο και έχει ξεκινήσει θεραπεία, τότε οι μοριακές βιολογικές εργαστηριακές πληροφορίες αναμένεται να καταστήσουν δυνατό τον εντοπισμό της κλίσης ενός ατόμου σε ορισμένους τύπους παθολογίας και του βαθμού ευαισθησίας σε ορισμένα φάρμακα, τα οποία θα επιτρέψει την τεκμηρίωση του προγνωστικού, προληπτικού και εξατομικευμένου χαρακτήρα της ιατρικής του μέλλοντος.

ΑΛΛΑΓΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΩΝ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ

Σήμερα Στο μέλλον

Διάγνωση Γενετικό διαβατήριο

8. Πόσες αίθουσες εργασίας απαιτούνται για ένα εργαστήριο PCR με ανίχνευση φθορισμού (ποσοτική ανάλυση, Real-Time PCR);

9. Τι είναι η ανίχνευση;

10. Ποιες μέθοδοι διάγνωσης DNA διακρίνονται;

11. Ποιο ένζυμο λειτουργεί με βάση την PCR;

12. Γιατί η ζώνη ανίχνευσης πρέπει να διαχωριστεί από άλλες ζώνες εργασίας;

13. Τι είναι η τοποθεσία περιορισμού;

14. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της άμεσης μεθόδου διάγνωσης DNA και της έμμεσης;

15. Τι είναι η αλληλουχία;

16. Τι είναι η multiplex PCR;

17. Ποιοι τύποι μεταλλάξεων προσδιορίζονται με PCR;

18. Τι είναι η μόλυνση;

19. Ποια είναι η ουσία της ειδικής για αλληλόμορφη μεθόδου ενίσχυσης;

20. Συνθήκες αποθήκευσης υλικού PCR;

21. Ποια συσκευή χρησιμοποιείται για την ενίσχυση;

22. Ποια είναι η μέθοδος της ανάστροφης μεταγραφάσης PCR (RT-PCR);

23. Ποιο είναι το υλικό για τη διάγνωση PCR;

24. Αναφέρετε τους τύπους μόλυνσης;

Τεστ για αυτοδιδασκαλία

1. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες:

α) ένζυμα που «σπάνε» το DNA σε αυστηρά συγκεκριμένα σημεία.

β) ένζυμα που ράβουν θραύσματα στο μόριο DNA.

γ) ένζυμα που παρέχουν ενώσεις που πραγματοποιούν την επιδιόρθωση του DNA.

2. Γονιδιακή ενίσχυση:

3. Ποια από τις μεθόδους της μοριακής γενετικής χρησιμοποιείται για τη διάγνωση ασθενειών που προκαλούνται από ένα μεταλλαγμένο γονίδιο γνωστής αλληλουχίας;

α) τη χρήση συγκεκριμένου περιορισμού·

β) άμεση ανίχνευση με χρήση ειδικών μοριακών ανιχνευτών.

γ) ανάλυση οικογένειας της κατανομής του πολυμορφισμού μήκους φυσιολογικού περιοριστικού θραύσματος.

4. Αλληλουχία DNA:

α) ταυτοποίηση της αλληλουχίας βάσεων DNA.

β) επαναλαμβανόμενη επανάληψη οποιουδήποτε τμήματος DNA.

γ) απομόνωση θραύσματος DNA που περιέχει το γονίδιο που μελετήθηκε.

5. Δείγματα DNA μπορούν να ληφθούν χρησιμοποιώντας :

β) χοριακές λάχνες.

γ) αμνιακό υγρό.

δ) κύτταρα αμνιακού υγρού.

ε) βιοψίες δέρματος, μυών, ήπατος,

ε) όλα είναι σωστά, εκτός από το σημείο "γ",

ζ) όλα είναι σωστά, εκτός από το σημείο "δ",

η) Όλα τα παραπάνω είναι σωστά.

6. Ποιες μεταλλάξεις διαγιγνώσκονται με PCR;

α) γονιδιωματικό·

β) χρωμοσωμική;

γ) γονίδιο (σημείο).

7. Το Primer είναι:

α) ένα συμπληρωματικό τμήμα DNA·

β) ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο επισημασμένη (ραδιενεργά ή φθορίζουσα) αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα μεταλλαγμένο ή φυσιολογικό γονίδιο.

γ) ένα ολιγονουκλεοτίδιο που δρα ως "σπόρος" και ξεκινά τη σύνθεση μιας πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας σε ένα πρότυπο DNA ή RNA.

8. Ποιος ανέπτυξε την αρχή της μεθόδου PCR;

β) Κ. Μούλλης

9. Χρησιμοποιείται η μέθοδος PCR για τη διάγνωση της επέκτασης των τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων (δυναμικός τύπος μεταλλάξεων);

10. Σε ποιες περιοχές χρησιμοποιείται η PCR;

α) κλινική ιατρική·

β) ορισμός των διαγονιδιακών οργανισμών (ΓΤΟ)

γ) ταυτοποίηση του προσώπου, διαπίστωση πατρότητας, εγκληματολογία

δ) όλα τα παραπάνω

δ) κανένα από τα παραπάνω.

Δείγματα απαντήσεων: 1 - α; 2 - β; 3 - β; 4 - α; 5 - e; 6 - σε; 7 - σε; 8 - β; 9 – α, 10 – ημ.

Κύριος

1. Γενετική Bochkov. Μόσχα. ΓΕΩΤΑΡ, 2002.

Πρόσθετος

1., Bakharev και η θεραπεία συγγενών και κληρονομικών ασθενειών στα παιδιά. - Μόσχα, 2004.

2. Διαγνωστική DNA και ιατρική γενετική συμβουλευτική. - Μόσχα, 2004.

3. Γενετική Ginter. - Μόσχα, 2003.

4. Gorbunov βασικές αρχές ιατρικής γενετικής. - Αγία Πετρούπολη: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Μοριακή κλινική διάγνωση. – Κόσμος, 1999.

6. Menshikov - βιολογική έρευνα στην κλινική εργαστηριακή διάγνωση: οι δυνατότητες του προβλήματος (διαλέξεις). Κλινική εργαστηριακή διαγνωστική, Νο 3, 2006.

7. Kornienko της εργασίας του εργαστηρίου PCR κατά την εν σειρά ανάλυση βιολογικού υλικού. Κλινική εργαστηριακή διαγνωστική, Νο 10, 2006.

8. Οργάνωση των εργασιών του εργαστηρίου PCR. Μεθοδικές οδηγίες. MU 1.3.1794-03. Επικεφαλής Υγειονομικός Ιατρός της Ρωσικής Ομοσπονδίας, 2003.

9. Τεχνολογία Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Genome Res. - Νο. 6, 1996.

ΚΥΡΙΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Μεθοδολογικό εγχειρίδιο εξωσχολικής εργασίας σπουδαστών 3-4 μαθημάτων των ειδικοτήτων γενικής ιατρικής (060101) και παιδιατρικής (060103).

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy of the Federal Agency for Health and Social Development"

Ρωσία, Κρασνογιάρσκ,

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια. Χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς, από την αρχαιολογία μέχρι τη γενετική.

Είναι η μέθοδος PCR που βοηθά στη διαπίστωση της πατρότητας, αλλά χρησιμοποιείται συχνότερα για την ανίχνευση διαφόρων μολυσματικών ασθενειών στο ανθρώπινο σώμα.

Πώς γίνεται η ανάλυση PCR και τι είναι; Θα προσπαθήσουμε να απαντήσουμε σε αυτές τις ερωτήσεις λεπτομερώς.

Ανάλυση PCR - τι είναι;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος μοριακής γενετικής διάγνωσης υψηλής ακρίβειας, η οποία καθιστά δυνατή την ανίχνευση διαφόρων μολυσματικών και κληρονομικών ασθενειών στον άνθρωπο, τόσο στο οξύ όσο και στο χρόνιο στάδιο και πολύ πριν εκδηλωθεί η ασθένεια.

Η μέθοδος PCR είναι απολύτως συγκεκριμένη και, όταν εκτελείται σωστά, δεν μπορεί να δώσει ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Δηλαδή, αν δεν υπάρχει μόλυνση, τότε η ανάλυση δεν θα δείξει ποτέ ότι είναι. Ως εκ τούτου, τώρα πολύ συχνά, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η διάγνωση, λαμβάνεται μια πρόσθετη ανάλυση PCR για να προσδιοριστεί το παθογόνο και η φύση του.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αναπτύχθηκε το 1983 από τον Cary Mullis (ΗΠΑ), για την οποία τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993.

Ποιο είναι το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου;

Η διάγνωση με αυτήν τη μέθοδο σάς επιτρέπει να βρείτε το παθογόνο απευθείας στο γονίδιο που περιέχεται στα μελετημένα υλικά. Αυτή είναι η πιο ακριβής ανάλυση για σεξουαλικές λοιμώξεις, λανθάνουσες λοιμώξεις, διάφορα σεξουαλικά μεταδιδόμενα νοσήματα.

Διαφορές μεταξύ διαγνωστικών PCR και άλλων μεθόδων εργαστηριακή έρευνα έχουν ως εξής:

• η μέθοδος στοχεύει στον εντοπισμό του ίδιου του παθογόνου.
• Η διάγνωση με PCR είναι ευέλικτη: για την ανίχνευση πολλών παθογόνων.
• ασθένειες, μόνο ένα βιολογικό δείγμα του ασθενούς είναι αρκετό.
• η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και δεν συνοδεύεται από άλλες διασταυρούμενες αντιδράσεις.

Επιπλέον, το πλεονέκτημα της διάγνωσης PCR είναι ότι οποιοδήποτε βιολογικό υλικό του ασθενούς είναι κατάλληλο για ανάλυση: αίμα, εκκρίσεις από τα γεννητικά όργανα, ούρα, σπέρμα.

Ποιες λοιμώξεις μπορούν να ανιχνευθούν με ένα επίχρισμα PCR;

Ένας μεγάλος αριθμός μολυσματικών παραγόντων μπορεί να υπάρχει στο σώμα, συμπεριλαμβανομένων των «κρυφών» που δεν εκδηλώνονται για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Ανάλυση επιχρίσματος PCR καθιστά δυνατό τον εντοπισμό τέτοιων λοιμώξεων:

• ουρεπλάσμωση των γεννητικών οργάνων.
• καντιντίαση ();
• έρπης;
• η παρουσία καρκινικών κυττάρων.
• αξιολογήστε την ορμονική κατάσταση.

Το υλικό που μελετάται για την PCR είναι συνήθως πτύελα, σάλιο, ούρα, αίμα. Πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης, είναι απαραίτητο να προετοιμαστείτε προσεκτικά για αυτήν, έχοντας λάβει μια προκαταρκτική διαβούλευση με έναν γιατρό.

Το αίμα για PCR δίνεται συνήθως με άδειο στομάχι. Καλά αποτελέσματα εμφανίζονται με ανάλυση όταν το υλικό για έρευνα λαμβάνεται από τον αυχενικό σωλήνα ή την ουρήθρα. Σε αυτή την περίπτωση, είναι καλύτερο να πραγματοποιήσετε διάγνωση PCR το αργότερο μία ημέρα μετά τη σεξουαλική επαφή.

Ποικιλίες PCR

Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς για ανάλυση και σε επιστημονικά πειράματα. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι ανάλυσης:

1. PCR αντίστροφης μεταγραφής(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (Αγγλικά)) - χρησιμοποιείται για την ενίσχυση, απομόνωση ή ταυτοποίηση μιας γνωστής αλληλουχίας από μια βιβλιοθήκη RNA.
2. Αντεστραμμένη PCR(Αντίστροφη PCR (Αγγλικά)) - χρησιμοποιείται εάν είναι γνωστή μόνο μια μικρή περιοχή εντός της επιθυμητής αλληλουχίας. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν είναι απαραίτητος ο προσδιορισμός γειτονικών αλληλουχιών μετά την εισαγωγή του DNA στο γονιδίωμα.
3. Η Nested PCR χρησιμοποιείται για τη μείωση του αριθμού των παραπροϊόντων μιας αντίδρασης. Χρησιμοποιήστε δύο ζεύγη εκκινητών και πραγματοποιήστε δύο διαδοχικές αντιδράσεις.
4. Ασύμμετρη PCR(Αγγλικά Asymmetric PCR) - πραγματοποιείται όταν είναι απαραίτητο να ενισχυθεί κυρίως μία από τις αλυσίδες του αρχικού DNA. Χρησιμοποιείται σε ορισμένες τεχνικές ανάλυσης αλληλουχίας και υβριδισμού.
5. Ποσοτική PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (Αγγλικά)) ή PCR σε πραγματικό χρόνο - χρησιμοποιείται για την άμεση παρατήρηση της μέτρησης της ποσότητας ενός συγκεκριμένου προϊόντος PCR σε κάθε κύκλο αντίδρασης.
6. Steped PCR (Touchdown PCR (Αγγλικά)) - χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, η επίδραση της μη ειδικής δέσμευσης των εκκινητών μειώνεται.
7. Ειδική για την ομάδα PCR(Αγγλικά group-specific PCR) - PCR για σχετικές αλληλουχίες εντός ενός ή μεταξύ διαφορετικών ειδών, χρησιμοποιώντας συντηρητικούς εκκινητές για αυτές τις αλληλουχίες.

Εάν η νουκλεοτιδική αλληλουχία του εκμαγείου είναι εν μέρει γνωστή ή δεν είναι καθόλου γνωστή, μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκφυλισμένοι εκκινητές, η αλληλουχία των οποίων περιέχει εκφυλισμένες θέσεις στις οποίες μπορούν να εντοπιστούν οποιεσδήποτε βάσεις. Για παράδειγμα, η αλληλουχία εκκινητών θα μπορούσε να είναι: …ATH… όπου H είναι A, T ή C.

Ποια βιολογικά υλικά μελετώνται;

Διάφορα βιολογικά μέσα και ανθρώπινα υγρά μπορούν να χρησιμεύσουν ως υλικό για έρευνα PCR, στην οποία μπορεί να ανιχνευθεί ξένο DNA ενός βακτηρίου ή DNA ή RNA ενός ιού:

1. Ούρο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μολυσματικές βλάβες του ουρογεννητικού συστήματος στους άνδρες και των ουροποιητικών οργάνων στις γυναίκες (στους άνδρες, η χρήση ούρων ως υλικό αντικαθιστά την απόξεση του επιθηλίου).
2. Φλέγμα. Χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της φυματίωσης και σπανιότερα για τη διάγνωση αναπνευστικών μορφών χλαμυδίων και μυκοπλάσμωσης. Τα πτύελα σε ποσότητα 15-20 ml συλλέγονται σε ένα αποστειρωμένο (μιας χρήσης) φιαλίδιο.
3. βιολογικά υγρά. Χυμός προστάτη, υπεζωκοτικό, εγκεφαλονωτιαίο, αμνιακό υγρό, αρθρικό υγρό, βρογχοκυψελιδική πλύση, σάλιο λαμβάνονται σύμφωνα με ενδείξεις.
4. Ξύσεις επιθηλίου από τους βλεννογόνους. Συνήθως χρησιμοποιείται για τη διάγνωση σεξουαλικά μεταδιδόμενων ασθενειών (ΣΜΝ), όπως γονόρροια, χλαμύδια, μυκοπλάσμωση, ουρεαπλάσμωση, τριχομονάση, γαρδνερέλλωση, ερπητικές και άλλες λοιμώξεις που επηρεάζουν τους βλεννογόνους.
5. Βιοψίες. Τις περισσότερες φορές, δείγματα βιοψίας του στομάχου και του δωδεκαδακτύλου χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού.
6. Αίμα, πλάσμα, ορός. Χρησιμοποιείται για ανάλυση PCR ιών ηπατίτιδας B, C, D, G, έρπητα, CMV, HIV, ανθρώπινα γονίδια.

Πώς να προετοιμαστείτε για την ανάλυση;

Η αξιοπιστία του αποτελέσματος της PCR εξαρτάται άμεσα από την ορθότητα της παράδοσης του υλικού προς εξέταση. Το υλικό δεν πρέπει να είναι μολυσμένο, διαφορετικά το αποτέλεσμα της μελέτης δεν θα είναι αντικειμενικό. Οι πιο σημαντικές συστάσεις πριν από τη λήψη μιας δοκιμής PCR περιλαμβάνουν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

1. Τα ούρα χορηγούνται το πρωί σε αποστειρωμένο δοχείο.
2. Μια εξέταση αίματος για λοιμώξεις πρέπει να γίνεται με άδειο στομάχι το πρωί.
3. Δεν πρέπει να είστε σεξουαλικά ενεργοί την ημέρα πριν από την εξέταση.

Το αποτέλεσμα της ανάλυσης θα είναι έτοιμο σε 1,5-2 ημέρες μετά την εν λόγω διαδικασία. Υπάρχουν περιπτώσεις που το αποτέλεσμα μπορεί να προετοιμαστεί την ίδια μέρα.

Αποκρυπτογράφηση της ανάλυσης του PRP

Η διαδικασία ερμηνείας της παρουσιαζόμενης μελέτης είναι αξιοσημείωτη για την απλότητά της. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης PCR μπορούν να ληφθούν 1,5-2 ημέρες μετά την παράδοση του υλικού. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αποτέλεσμα είναι έτοιμο την πρώτη μέρα και αυτό μπορεί να σημαίνουν:

• Αρνητικό αποτέλεσμαδείχνει ότι το υλικό που διαγιγνώσκεται δεν περιέχει τον επιθυμητό μολυσματικό παράγοντα.
• PCR θετικήυποδεικνύει ότι το DNA ή το RNA του παθογόνου είναι παρόν στο ανθρώπινο σώμα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός μικροοργανισμών. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα σε ασθένειες που προκαλούνται από ευκαιριακά παθογόνα. Δεδομένου ότι αυτά τα βακτήρια δείχνουν τα αρνητικά τους αποτελέσματα μόνο όταν είναι σε περίσσεια.

Επίσης, η ποσοτική ανάλυση PCR είναι σημαντική για την επιλογή των θεραπευτικών τακτικών και για τον σκοπό της παρακολούθησης της θεραπείας τέτοιων ιογενείς λοιμώξειςόπως οι ιοί HIV και ηπατίτιδας.

Πόσο ακριβής είναι η PCR στη διάγνωση λοιμώξεων;

Η μέθοδος PCR χαρακτηρίζεται από υψηλή ακρίβεια, ειδικότητα και ευαισθησία. Αυτό σημαίνει ότι αυτή η ανάλυση είναι ικανή:

• να προσδιορίσει με ακρίβεια την παρουσία ή την απουσία μόλυνσης.
• προσδιορίστε ακριβώς τι είδους μόλυνση είναι (ειδικότητα).
• ανίχνευση μόλυνσης ακόμη και σε πολύ χαμηλή περιεκτικότητα μικροβιακού DNA σε βιολογικό υλικό,
• που έχει δοκιμαστεί (ευαισθησία).

Ανάλυση PCR: τιμή και όροι

Η τιμή μιας συγκεκριμένης ανάλυσης θα εξαρτηθεί από τη μόλυνση για την οποία θα υποβληθείτε σε εξέταση. Κατά προσέγγιση τιμές και όροι:

1. STI: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
2. Ιός Epstein-Barr, ιός ανθρώπινων θηλωμάτων, έρπης, κυτταρομεγαλοϊός: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
3. Ηπατίτιδα A, B, C, D, G: ποιοτική ανάλυση 650 ρούβλια, ποσοτική ανάλυση 2000 ρούβλια. Όροι - έως 5 ημέρες.
4. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, συνολικά (Anti-HCV) - 420 ρούβλια.
5. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 ρούβλια.
6. Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (Helicobacter pylori): 300-400 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
7. HIV (αντισώματα και αντιγόνα) - 380 ρούβλια.
8. HIV RNA, ποιοτικά - 3.500 ρούβλια.
9. HIV RNA, ποσοτικά - 11.000 ρούβλια.

Για να εξοικονομήσετε χρήματα, μπορείτε να επιλέξετε ένα σταθερό πακέτο αναλύσεων. Αυτή η υπηρεσία παρέχεται από τις περισσότερες κλινικές όπου μπορείτε να κάνετε μια ανάλυση χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PRC (in vitro, onclinic κ.λπ.).

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, PCR - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι μια μέθοδος για τη λήψη πολλαπλών αντιγράφων ορισμένων θραυσμάτων DNA (γονιδίων) σε ένα βιολογικό δείγμα.

Η ουσία της PCR ως μεθόδου μοριακής βιολογίας είναι η επαναλαμβανόμενη επιλεκτική αντιγραφή ενός συγκεκριμένου γονιδίου (τμήμα DNA) χρησιμοποιώντας ειδικά ένζυμα υπό συνθήκες in vitro. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της PCR είναι η λήψη αντιγράφων μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA (γονιδίου) που πληροί συγκεκριμένες συνθήκες. Συνώνυμο της διαδικασίας αντιγραφής DNA είναι η «ενίσχυση». Αντιγραφή DNA in vivoμπορεί επίσης να θεωρηθεί ενίσχυση. Ωστόσο, σε αντίθεση με την αντιγραφή, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ενισχύει μικρά τμήματα DNA (μέγιστο 40.000 ζεύγη βάσεων).

Βασικές αρχές

Έτσι, η PCR είναι η επαναλαμβανόμενη αντιγραφή ορισμένων θραυσμάτων DNA in vitro στη διαδικασία επαναλαμβανόμενων κύκλων θερμοκρασίας. Πώς εξελίσσεται η αντίδραση σε έναν κύκλο θερμοκρασίας;

Ο σχηματισμός μιας νουκλεοτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται από το ένζυμο πολυμεράση DNA. Ωστόσο, το ένζυμο χρειάζεται μια επιφάνεια εκτόξευσης για να ξεκινήσει. Οι θέσεις είναι "εκκινητές" (σπόροι) - συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μήκους 15-20 νουκλεοτιδίων. Θα πρέπει να υπάρχουν δύο εκκινητές (προς τα εμπρός και προς τα πίσω), είναι συμπληρωματικοί με τα τμήματα του προτύπου DNA και είναι το τμήμα DNA που περιορίζεται από εκκινητές που θα αντιγραφεί επανειλημμένα από την πολυμεράση DNA. Η δουλειά της πολυμεράσης είναι να προσθέτει διαδοχικά νουκλεοτίδια που είναι συμπληρωματικά στην αλληλουχία DNA του εκμαγείου. Έτσι, σε έναν κύκλο θερμοκρασίας, συντίθενται και πάλι δύο νέα θραύσματα DNA (καθώς το μόριο DNA είναι δίκλωνο, υπάρχουν αρχικά δύο εκμαγεία). Έτσι, σε 25-35 κύκλους, δισεκατομμύρια αντίγραφα της περιοχής DNA που προσδιορίζεται από τους εκκινητές συσσωρεύονται στον δοκιμαστικό σωλήνα. Η δομή ενός μεμονωμένου κύκλου μπορεί να αναπαρασταθεί ως εξής:

1. Μετουσίωσης DNA (τήξη, διαχωρισμός αλυσίδας DNA) - 95°C - 1 ή 2 λεπτά.
2. ανόπτηση εκκινητών (οι σπόροι συνδέονται με το εκμαγείο DNA, η θερμοκρασία αυτού του σταδίου προσδιορίζεται από τη νουκλεοτιδική σύνθεση του εκκινητή) - 60°C (για παράδειγμα) - 1 λεπτό.
3. επιμήκυνση του DNA (η πολυμεράση συνθέτει μια αλυσίδα DNA) - 72 ° C - 1 λεπτό (ο χρόνος εξαρτάται από το μήκος του θραύσματος που συντίθεται).

Η βάση οργάνων για την εφαρμογή της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στο εργαστήριο θα πρέπει να αποτελείται από:

1. (ή, όπως λέγεται επίσης, θερμικός κυκλοποιητής).
2. συστήματα για s (για οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων PCR).
3. συστήματα (για ανάλυση των αποτελεσμάτων PCR).
4. (για προετοιμασία δείγματος).
5. σετ (μηχανικό ή ηλεκτρονικό).

Εκτός από τον κύριο και τον βοηθητικό εξοπλισμό για την πλήρη λειτουργία του εργαστηρίου PCR, απαιτούνται ορισμένα αναλώσιμα: αποστειρωμένα άκρα, δοκιμαστικοί σωλήνες, σχάρες για δοκιμαστικούς σωλήνες και διανομείς.

Η βάση αντιδραστηρίου σε ένα συμβατικό εργαστήριο PCR για τη διεξαγωγή μιας πλήρους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης περιλαμβάνει ένα ένζυμο πολυμεράσης DNA με ρυθμιστικό διάλυμα, εκκινητές (μικρά συνθετικά θραύσματα DNA συμπληρωματικά στην αρχή και το τέλος του αναλυόμενου τμήματος του προτύπου DNA), ένα μείγμα των νουκλεοτιδίων (A, T, D, C). Το καθαρισμένο νερό είναι επίσης απολύτως απαραίτητο.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου PCR

Υψηλή ευαισθησία της μελέτης

Η ευαισθησία της μεθόδου είναι τέτοια που είναι δυνατή η ενίσχυση σε PCR και η ταυτοποίηση της αλληλουχίας στόχου ακόμη και αν συμβεί μία φορά σε ένα δείγμα 105 κυττάρων.

Ειδικότητα ανάλυσης

Η PCR επιτρέπει την ανίχνευση του DNA ενός συγκεκριμένου μολυσματικού παράγοντα παρουσία DNA από άλλους μικροοργανισμούς και του DNA του οργανισμού ξενιστή, καθώς και τον προσδιορισμό γονότυπου. Επιλέγοντας συγκεκριμένα συστατικά της αντίδρασης (primers), μπορείτε ταυτόχρονα να ανιχνεύσετε το DNA των στενά συγγενών μικροοργανισμών.

Καθολικότητα της μεθόδου PCR

Γεγονός είναι ότι για τη διάγνωση PCR μολυσματικών ασθενειών ή ανθρώπινων κληρονομικών ασθενειών, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον ίδιο εξοπλισμό, να ακολουθήσετε τις καθολικές διαδικασίες για την προετοιμασία δειγμάτων (δειγμάτων) και τη ρύθμιση της ανάλυσης, καθώς και του ίδιου τύπου κιτ αντιδραστηρίων.

Εξοικονόμηση χρόνου

Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της PCR είναι η απουσία σταδίων πολιτιστικής μικροβιολογικής εργασίας. Η προετοιμασία των δειγμάτων, η διεξαγωγή της αντίδρασης και η ανάλυση των αποτελεσμάτων διευκολύνεται στο μέγιστο και σε μεγάλο βαθμό αυτοματοποιείται. Λόγω αυτού, ο χρόνος για την απόκτηση του αποτελέσματος μπορεί να μειωθεί σε 4-5 ώρες.

Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου PCR

Πλάτος του μελετημένου κλινικού υλικού

Ως δείγμα στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο βιολογικό υλικό από τον ασθενή, αλλά και πολλά άλλα υποστρώματα στα οποία μπορούν να αναγνωριστούν μόρια DNA με υψηλή ευαισθησία, για παράδειγμα, νερό, χώμα, τρόφιμα, μικροοργανισμοί, πλύσεις και πολύ περισσότερο.

Όλα τα πλεονεκτήματα αυτής της μοναδικής μεθόδου που αναφέρονται παραπάνω - υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, ταυτοποίηση μολυσματικού παράγοντα και γονότυπος οποιουδήποτε ανθρώπινου γονιδίου, υψηλή απόδοση και εξοικονόμηση χρόνου, καθολικότητα της βάσης οργάνων - επιτρέπουν στην μέθοδο PCR να χρησιμοποιείται ευρέως σήμερα στην κλινική διαγνωστικά, ιατρική πρακτική, την επιστημονική έρευνα, τον ποιοτικό έλεγχο και πολλούς άλλους τομείς.

Εφαρμογή PCR

Οι τομείς εφαρμογής της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ως σύγχρονης μεθόδου μοριακής βιολογίας είναι ποικίλοι. Αυτό οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο εύρος του υλικού που μπορεί να αναλυθεί (σχεδόν οτιδήποτε από το οποίο μπορεί να απομονωθεί περισσότερο ή λιγότερο DNA υψηλής ποιότητας μπορεί να γίνει αντικείμενο μελέτης), καθώς και των επιλεγμένων εκκινητών. Οι κύριοι τομείς εφαρμογής της PCR:

κλινικό φάρμακο

• διάγνωση μολυσματικών ασθενειών
• διάγνωση κληρονομικών ασθενειών
• ανίχνευση μεταλλάξεων
• γονότυπος
• κυτταρικές τεχνολογίες
• δημιουργία γενετικών διαβατηρίων

οικολογία

• περιβαλλοντική παρακολούθηση
• ανάλυση τροφίμων
• ανάλυση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (ΓΤΟ)

ιατροδικαστική και εγκληματολογία

• προσωπική αναγνώριση
• πατρότητα

φαρμακολογία

κτηνιατρική

επιστημονική έρευνα (μοριακή βιολογία, γενετική)

Οργάνωση εργαστηρίου PCR

Πληροφορίες Παραγγελίας

Ονομα	Ενταση ΗΧΟΥ	Παραγωγή	Μέθοδος	Cat.Αριθμός

1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

2. Αρχή της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

2.1 Παρουσία ενός αριθμού συστατικών στο μίγμα της αντίδρασης

2.2 Κύκλος θερμοκρασίας

2.3 Βασικές αρχές επιλογής ασταριού

2.4 Εφέ οροπεδίου

3. Στάδια ρύθμισης PCR

3.2 Ενίσχυση

3.4.1 Θετικοί έλεγχοι

3.4.2 Εσωτερικοί έλεγχοι

4.1 Ποιοτική ανάλυση

4.1.2 Ανίχνευση μορίων RNA

3.1 Παρασκευή δειγμάτων βιολογικού υλικού

Για την εξαγωγή DNA χρησιμοποιούνται διαφορετικές τεχνικές, ανάλογα με τις εργασίες. Η ουσία τους έγκειται στην εξαγωγή (εκχύλιση) DNA από ένα βιολογικό προϊόν και στην απομάκρυνση ή εξουδετέρωση ξένων ακαθαρσιών για να ληφθεί ένα παρασκεύασμα DNA με καθαρότητα κατάλληλη για PCR.

Η μέθοδος λήψης ενός παρασκευάσματος καθαρού DNA, που περιγράφεται από τη Marmur, θεωρείται τυπική και έχει ήδη γίνει κλασική. Περιλαμβάνει ενζυματική πρωτεόλυση που ακολουθείται από αποπρωτεϊνοποίηση και επανακαταβύθιση DNA με αλκοόλη. Αυτή η μέθοδος καθιστά δυνατή τη λήψη ενός καθαρού παρασκευάσματος DNA. Ωστόσο, είναι αρκετά επίπονη και περιλαμβάνει εργασία με τέτοιες επιθετικές και πικάντικες ουσίες όπως η φαινόλη και το χλωροφόρμιο.

Μία από τις επί του παρόντος δημοφιλείς μεθόδους είναι η μέθοδος εξαγωγής DNA που προτείνεται από τους Boom et al. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη χρήση ενός ισχυρού χαοτροπικού παράγοντα, της θειοκυανικής γουανιδίνης (GuSCN), για τη λύση των κυττάρων και την επακόλουθη προσρόφηση DNA σε έναν φορέα (γυάλινες χάντρες, γη διατόμων, γυάλινο γάλα, κ.λπ.). Μετά τις πλύσεις, το DNA παραμένει στο δείγμα προσροφημένο στον φορέα, από τον οποίο μπορεί εύκολα να αφαιρεθεί χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Η μέθοδος είναι βολική, τεχνολογικά προηγμένη και κατάλληλη για προετοιμασία δείγματος για ενίσχυση. Ωστόσο, είναι πιθανές απώλειες DNA λόγω μη αναστρέψιμης προσρόφησης στον φορέα, καθώς και κατά τη διάρκεια πολλών πλύσεων. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν εργάζεστε με μικρές ποσότητες DNA στο δείγμα. Επιπλέον, ακόμη και ίχνη GuSCN μπορούν να αναστείλουν την PCR. Επομένως, κατά τη χρήση αυτής της μεθόδου, η σωστή επιλογή του ροφητή και η προσεκτική τήρηση των τεχνολογικών αποχρώσεων είναι πολύ σημαντικές.

Μια άλλη ομάδα μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων βασίζεται στη χρήση ιονανταλλακτών τύπου Chilex, οι οποίοι, σε αντίθεση με το γυαλί, δεν προσροφούν DNA, αλλά αντίστροφα, ακαθαρσίες που παρεμβαίνουν στην αντίδραση. Κατά κανόνα, αυτή η τεχνολογία περιλαμβάνει δύο στάδια: βρασμό δείγματος και προσρόφηση ακαθαρσιών σε ιονανταλλάκτη. Η μέθοδος είναι εξαιρετικά ελκυστική λόγω της απλότητας εκτέλεσής της. Στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι κατάλληλο για εργασία με κλινικό υλικό. Δυστυχώς, μερικές φορές υπάρχουν δείγματα με ακαθαρσίες που δεν μπορούν να αφαιρεθούν χρησιμοποιώντας εναλλάκτες ιόντων. Επιπλέον, ορισμένοι μικροοργανισμοί δεν μπορούν να καταστραφούν με απλό βράσιμο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι απαραίτητο να εισαχθούν πρόσθετα στάδια επεξεργασίας του δείγματος.

Επομένως, η επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας του δείγματος θα πρέπει να αντιμετωπίζεται με κατανόηση των σκοπών των επιδιωκόμενων αναλύσεων.

3.2 Ενίσχυση

Για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση ενίσχυσης, είναι απαραίτητο να παρασκευαστεί το μείγμα αντίδρασης και να προστεθεί το αναλυθέν δείγμα DNA σε αυτό. Σε αυτή την περίπτωση, είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη ορισμένα χαρακτηριστικά της ανόπτησης με αστάρι. Το γεγονός είναι ότι, κατά κανόνα, στο αναλυόμενο βιολογικό δείγμα υπάρχουν διάφορα μόρια DNA, στα οποία οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση έχουν μερική, και σε ορισμένες περιπτώσεις σημαντική, ομολογία. Επιπλέον, οι εκκινητές μπορούν να ανόπτονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν εκκινητές-διμερή. Και τα δύο οδηγούν σε σημαντική κατανάλωση εκκινητών για τη σύνθεση πλευρικών (μη ειδικών) προϊόντων αντίδρασης και, ως εκ τούτου, μειώνουν σημαντικά την ευαισθησία του συστήματος. Αυτό καθιστά δύσκολη ή αδύνατη την ανάγνωση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης κατά την ηλεκτροφόρηση.

3.3 Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης

Προκειμένου να αξιολογηθούν σωστά τα αποτελέσματα της PCR, είναι σημαντικό να το κατανοήσουμε αυτό αυτή τη μέθοδοδεν είναι ποσοτική. Θεωρητικά, τα προϊόντα ενίσχυσης μορίων DNA ενός στόχου μπορούν να ανιχνευθούν με ηλεκτροφόρηση ήδη μετά από 30-35 κύκλους. Ωστόσο, στην πράξη αυτό γίνεται μόνο σε περιπτώσεις που η αντίδραση γίνεται κάτω από συνθήκες κοντά στο ιδανικό, κάτι που δεν συναντάται συχνά στη ζωή. Ο βαθμός καθαρότητας του παρασκευάσματος DNA έχει ιδιαίτερα μεγάλη επίδραση στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης. την παρουσία ορισμένων αναστολέων στο μείγμα αντίδρασης, από τους οποίους σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να είναι εξαιρετικά δύσκολο να απαλλαγούμε. Μερικές φορές, λόγω της παρουσίας τους, δεν είναι δυνατό να ενισχυθούν ακόμη και δεκάδες χιλιάδες μόρια DNA-στόχοι. Έτσι, συχνά δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ της αρχικής ποσότητας του DNA στόχου και της τελικής ποσότητας προϊόντων ενίσχυσης.

3.3.1 Μέθοδος οριζόντιας ηλεκτροφόρησης

Διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων της ενίσχυσης. Η πιο διαδεδομένη σήμερα είναι η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης, που βασίζεται στον διαχωρισμό των μορίων DNA κατά μέγεθος. Για να γίνει αυτό, παρασκευάζεται μια πλάκα γέλης αγαρόζης, η οποία καταψύχεται αγαρόζη μετά από τήξη σε ηλεκτροφορητικό ρυθμιστικό διάλυμα σε συγκέντρωση 1,5-2,5% με την προσθήκη ειδικής χρωστικής DNA, για παράδειγμα βρωμιούχου αιθιδίου. Η παγωμένη αγαρόζη σχηματίζει ένα χωρικό πλέγμα. Κατά την έκχυση με τη βοήθεια χτενών, σχηματίζονται ειδικά φρεάτια στο πήκτωμα, στα οποία στη συνέχεια προστίθενται προϊόντα ενίσχυσης. Η πλάκα γέλης τοποθετείται σε μια οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης γέλης και συνδέεται μια πηγή σταθερής τάσης. Το αρνητικά φορτισμένο DNA αρχίζει να κινείται στο πήκτωμα από το μείον στο συν. Ταυτόχρονα, τα μικρότερα μόρια DNA κινούνται πιο γρήγορα από τα μακρά. Η ταχύτητα της κίνησης του DNA στο πήκτωμα επηρεάζεται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης, την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, τη θερμοκρασία, τη σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης και, σε μικρότερο βαθμό, τη σύνθεση GC του DNA. Όλα τα μόρια του ίδιου μεγέθους κινούνται με την ίδια ταχύτητα. Η χρωστική ενσωματώνεται (ενσωματώνεται) σε επίπεδες ομάδες σε μόρια DNA. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, που διαρκεί από 10 λεπτά έως 1 ώρα, η γέλη τοποθετείται στο φίλτρο ενός transilluminator που εκπέμπει φως στην περιοχή υπεριώδους (254 - 310 nm). Η ενέργεια UV που απορροφάται από το DNA στα 260 nm μεταφέρεται στη χρωστική, προκαλώντας τον φθορισμό της στην πορτοκαλοκόκκινη περιοχή του ορατού φάσματος (590 nm).

Η φωτεινότητα των ζωνών των προϊόντων ενίσχυσης μπορεί να είναι διαφορετική. Ωστόσο, αυτό δεν μπορεί να συσχετιστεί με την αρχική ποσότητα του DNA στόχου στο δείγμα.

3.3.2 Μέθοδος κάθετης ηλεκτροφόρησης

Η μέθοδος της κάθετης ηλεκτροφόρησης είναι ουσιαστικά παρόμοια με την οριζόντια ηλεκτροφόρηση. Η διαφορά τους έγκειται στο γεγονός ότι σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούνται πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου αντί για αγαρόζη. Πραγματοποιείται σε ειδικό θάλαμο για κάθετη ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου έχει υψηλότερη ανάλυση από την ηλεκτροφόρηση αγαρόζης και καθιστά δυνατή τη διάκριση μορίων DNA διαφορετικών μεγεθών με ακρίβεια ενός νουκλεοτιδίου. Η παρασκευή γέλης πολυακρυλαμιδίου είναι κάπως πιο περίπλοκη από την αγαρόζη. Επιπλέον, το ακρυλαμίδιο είναι τοξική ουσία. Δεδομένου ότι σπάνια προκύπτει η ανάγκη προσδιορισμού του μεγέθους του προϊόντος ενίσχυσης με ακρίβεια 1 νουκλεοτιδίου, η μέθοδος της οριζόντιας ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται σε εργασίες ρουτίνας.

3.4 Παρακολούθηση της προόδου της αντίδρασης ενίσχυσης

3.4.1 Θετικοί έλεγχοι

Ως «θετικό έλεγχο» χρησιμοποιήστε το παρασκεύασμα DNA του επιθυμητού μικροοργανισμού. Τα μη ειδικά αμπλικόνια διαφέρουν σε μέγεθος από τα αμπλικόνια που παράγονται από την ενίσχυση με ένα παρασκεύασμα DNA ελέγχου. Το μέγεθος των μη ειδικών προϊόντων μπορεί να είναι είτε μεγαλύτερο είτε μικρότερο από τον θετικό έλεγχο. Στη χειρότερη περίπτωση, αυτές οι διαστάσεις μπορεί να συμπίπτουν και να διαβάζονται στην ηλεκτροφόρηση ως θετικές.

Για τον έλεγχο της εξειδίκευσης του προκύπτοντος προϊόντος ενίσχυσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ανιχνευτές υβριδισμού (περιοχές DNA που βρίσκονται εντός της ενισχυόμενης αλληλουχίας) σημασμένοι με ενζυμικές επισημάνσεις ή ραδιενεργά ισότοπα και αλληλεπιδρούν με το DNA σύμφωνα με τις ίδιες αρχές με τους εκκινητές. Αυτό περιπλέκει και επιμηκύνει πολύ την ανάλυση και το κόστος της αυξάνεται σημαντικά.

3.4.2 Εσωτερικοί έλεγχοι

Είναι απαραίτητο να ελέγχεται η πρόοδος της ενίσχυσης σε κάθε σωλήνα με το μείγμα αντίδρασης. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται ένας πρόσθετος, ο λεγόμενος «εσωτερικός έλεγχος». Είναι οποιοδήποτε παρασκεύασμα DNA που δεν είναι παρόμοιο με το DNA του επιθυμητού μικροοργανισμού. Εάν ο εσωτερικός μάρτυρας προστεθεί στο μείγμα της αντίδρασης, τότε θα γίνει ο ίδιος στόχος για την ανόπτηση του εκκινητή με το χρωμοσωμικό DNA του επιθυμητού μολυσματικού παράγοντα. Το μέγεθος του προϊόντος ενίσχυσης εσωτερικού ελέγχου επιλέγεται έτσι ώστε να είναι 2 ή περισσότερες φορές μεγαλύτερο από τα αμπλικόνια που παράγονται από την ενίσχυση του DNA στόχου του μικροοργανισμού. Ως αποτέλεσμα, εάν το DNA εσωτερικού ελέγχου εισαχθεί στο μείγμα αντίδρασης μαζί με το δείγμα δοκιμής, τότε ανεξάρτητα από την παρουσία μικροοργανισμού στο βιολογικό δείγμα, ο εσωτερικός μάρτυρας θα προκαλέσει το σχηματισμό συγκεκριμένων αμπλικονίων, αλλά πολύ μεγαλύτερα (βαρύτερα) από το αμπλικόνιο του μικροοργανισμού. Η παρουσία βαρέων αμπλικονίων στο μίγμα της αντίδρασης θα υποδεικνύει την κανονική πορεία της αντίδρασης ενίσχυσης και την απουσία αναστολέων. Εάν δεν σχηματίστηκαν τα αμπλικόνια του απαιτούμενου μεγέθους, αλλά δεν σχηματίστηκαν ούτε τα αμπλικόνια εσωτερικού ελέγχου, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το αναλυόμενο δείγμα περιέχει ανεπιθύμητες ακαθαρσίες που πρέπει να εξαλειφθούν, αλλά όχι την απουσία του επιθυμητού DNA.

Δυστυχώς, παρά την ελκυστικότητα αυτής της προσέγγισης, έχει ένα σημαντικό ελάττωμα. Εάν το απαιτούμενο DNA υπάρχει στο μείγμα της αντίδρασης, τότε η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης του μειώνεται απότομα λόγω του ανταγωνισμού με τον εσωτερικό μάρτυρα για εκκινητές. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε χαμηλές συγκεντρώσεις DNA στο δείγμα δοκιμής, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

Ωστόσο, υπό τον όρο ότι λυθεί το πρόβλημα του ανταγωνισμού για εκκινητές, αυτή η μέθοδος ελέγχου της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης θα είναι σίγουρα πολύ χρήσιμη.

4. Μέθοδοι που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

4.1 Ποιοτική ανάλυση

Η κλασική μέθοδος εγκατάστασης της PCR, οι αρχές της οποίας σκιαγραφήθηκαν παραπάνω, έχει αναπτυχθεί σε ορισμένες τροποποιήσεις που στοχεύουν στην υπέρβαση των περιορισμών της PCR και στην αύξηση της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης.

4.1.1 Πώς να ρυθμίσετε την PCR χρησιμοποιώντας "hot start"

Για να μειωθεί ο κίνδυνος σχηματισμού μη ειδικών προϊόντων της αντίδρασης ενίσχυσης, χρησιμοποιείται μια προσέγγιση που ονομάζεται «hot-start» Η ουσία της είναι να αποτρέψει την πιθανότητα έναρξης της αντίδρασης έως ότου επιτευχθούν οι συνθήκες στο σωλήνα που εξασφαλίζουν ειδική ανόπτηση του αστάρια.

Το γεγονός είναι ότι, ανάλογα με τη σύνθεση και το μέγεθος του HC, τα αστάρια έχουν μια ορισμένη θερμοκρασία τήξης (Tm). Εάν η θερμοκρασία του συστήματος υπερβαίνει το Tm, ο εκκινητής δεν μπορεί να προσκολληθεί στον κλώνο DNA και να μετουσιωθεί. Υπό βέλτιστες συνθήκες, δηλ. θερμοκρασία ανόπτησης κοντά στη θερμοκρασία τήξης, ο εκκινητής σχηματίζει ένα δίκλωνο μόριο μόνο εάν είναι πλήρως συμπληρωματικό και έτσι διασφαλίζει την ειδικότητα της αντίδρασης.

Υπάρχουν διάφορες επιλογές για την υλοποίηση μιας «καυτής εκκίνησης»:

Εισαγωγή πολυμεράσης Taq στο μίγμα αντίδρασης κατά τον πρώτο κύκλο μετά τη θέρμανση του σωλήνα στη θερμοκρασία μετουσίωσης.

Διαχωρισμός των συστατικών του μείγματος αντίδρασης με μια στρώση παραφίνης σε στιβάδες (εκκινητές στο κάτω μέρος, Taq πολυμεράση και DNA στόχος στο πάνω μέρος), οι οποίες αναμειγνύονται όταν λιώσει η παραφίνη (~65-75 0 C).

Χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά της πολυμεράσης Taq. Το ένζυμο που δεσμεύεται από μονοκλωνικά αντισώματα γίνεται ενεργό μόνο μετά το πρώτο στάδιο μετουσίωσης, όταν τα μονοκλωνικά αντισώματα μετουσιώνονται μη αναστρέψιμα και απελευθερώνουν τις ενεργές θέσεις της πολυμεράσης Taq.

Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, ακόμη και αν συνέβη μη ειδική ανόπτηση πριν από την έναρξη του θερμικού κύκλου, δεν συμβαίνει επιμήκυνση και τα σύμπλοκα εναρκτήρα-DNA μετουσιώνονται κατά τη θέρμανση, επομένως δεν σχηματίζονται μη ειδικά προϊόντα. Στη συνέχεια, η θερμοκρασία στο σωλήνα δεν πέφτει κάτω από το σημείο τήξης, γεγονός που εξασφαλίζει το σχηματισμό ενός συγκεκριμένου προϊόντος ενίσχυσης.

4.1.2 Ανίχνευση μορίων RNA

Η δυνατότητα χρήσης RNA ως στόχου για PCR διευρύνει σημαντικά το εύρος των εφαρμογών αυτής της μεθόδου. Για παράδειγμα, τα γονιδιώματα πολλών ιών (ηπατίτιδα C, ιός γρίπης, picornaviruses κ.λπ.) αντιπροσωπεύονται από RNA. Ταυτόχρονα, δεν υπάρχει ενδιάμεση φάση μετατροπής σε DNA στους κύκλους ζωής τους. Για να ανιχνευθεί το RNA, πρέπει πρώτα να μετατραπεί σε μορφή DNA. Για αυτό, χρησιμοποιείται η αντίστροφη μεταγραφάση, η οποία απομονώνεται από δύο διαφορετικούς ιούς: τον ιό της μυελοβλάστωσης των πτηνών και τον ιό της λευχαιμίας ποντικού Moloney. Η χρήση αυτών των ενζύμων συνδέεται με κάποιες δυσκολίες. Πρώτα απ 'όλα, είναι θερμοευαίσθητα και επομένως μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 42 ° C. Δεδομένου ότι σε αυτή τη θερμοκρασία τα μόρια RNA σχηματίζουν εύκολα δευτερογενείς δομές, η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης μειώνεται αισθητά και, σύμφωνα με διάφορες εκτιμήσεις, είναι περίπου 5%. Γίνονται προσπάθειες να παρακαμφθεί αυτό το μειονέκτημα χρησιμοποιώντας μια θερμοσταθερή πολυμεράση που λαμβάνεται από τον θερμόφιλο μικροοργανισμό Thermus Thermophilus, ο οποίος εμφανίζει δράση μεταγραφάσης παρουσία Mn2+, ως αντίστροφη μεταγραφάση. Είναι το μόνο γνωστό ένζυμο ικανό να εμφανίζει δραστικότητα τόσο πολυμεράσης όσο και μεταγραφάσης.

Για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής, το μείγμα της αντίδρασης, καθώς και στην PCR, πρέπει να περιέχει εκκινητές ως σπόρους και ένα μείγμα 4 dNTPs ως δομικό υλικό.

Μετά την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής, τα προκύπτοντα μόρια cDNA μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχος για PCR.

5. Οργάνωση της τεχνολογικής διαδικασίας ρύθμισης PCR

Η δυνητικά υψηλή ευαισθησία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης καθιστά απολύτως απαραίτητο να έχουμε έναν ιδιαίτερα προσεκτικό σχεδιασμό του εργαστηρίου PCR. Αυτό οφείλεται στο οξύτερο πρόβλημα της μεθόδου - μόλυνση.

Μόλυνση - είσοδος από το εξωτερικό περιβάλλον στο μείγμα αντίδρασης συγκεκριμένων μορίων DNA που μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχοι στην αντίδραση ενίσχυσης και να δώσουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Υπάρχουν διάφοροι τρόποι αντιμετώπισης αυτού του δυσάρεστου φαινομένου. Ένα από αυτά είναι η χρήση του ενζύμου N-uracil glycosylase (UG). Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα του UG να διασπά μόρια DNA με ενσωματωμένη ουρακίλη. Η αντίδραση ενίσχυσης πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα μίγμα dNTP στο οποίο το dTTP αντικαθίσταται από ουρακίλη και μετά τον θερμικό κύκλο, όλα τα αμπλικόνια που σχηματίζονται στον σωλήνα θα περιέχουν ουρακίλη. Εάν προστεθεί HC στο μίγμα της αντίδρασης πριν από την ενίσχυση, τότε τα αμπλικόνια που εισέρχονται στο μείγμα αντίδρασης θα καταστραφούν, ενώ το φυσικό DNA θα παραμείνει ανέπαφο και στη συνέχεια θα χρησιμεύσει ως στόχος για ενίσχυση.

Έτσι, αυτή η μέθοδος εξαλείφει μόνο σε κάποιο βαθμό την πηγή μόλυνσης και δεν εγγυάται τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Ένας άλλος τρόπος αντιμετώπισης των αποτελεσμάτων της μόλυνσης είναι η σημαντική μείωση του αριθμού των κύκλων αντίδρασης (μέχρι 25-30 κύκλους). Αλλά ακόμη και με αυτήν την προσέγγιση, ο κίνδυνος λήψης ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων είναι υψηλός, επειδή σε αυτήν την περίπτωση, ελλείψει αναστολέων, είναι εύκολο να ληφθεί ένα προϊόν ενίσχυσης λόγω μόλυνσης.

Έτσι, παρά τα οφέλη των μέτρων προενίσχυσης που στοχεύουν στην αδρανοποίηση μορίων DNA που προκαλούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα, το πιο ριζικό φάρμακο είναι μια καλά μελετημένη οργάνωση του εργαστηρίου.

συμπέρασμα

Η μέθοδος PCR είναι σήμερα η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη ως μέθοδος για τη διάγνωση διαφόρων μολυσματικών ασθενειών. Η PCR σάς επιτρέπει να προσδιορίσετε την αιτιολογία της μόλυνσης, ακόμη και αν το δείγμα που λαμβάνεται για ανάλυση περιέχει μόνο λίγα μόρια DNA του παθογόνου. Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως στην έγκαιρη διάγνωση λοιμώξεων από τον ιό HIV, ιογενούς ηπατίτιδας κ.λπ. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει σχεδόν κανένας μολυσματικός παράγοντας που να μην μπορεί να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας PCR.