पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)- आणविक जीव विज्ञान की प्रायोगिक विधि, जो सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों द्वारा प्रेरित न्यूक्लिक एसिड का एक विशिष्ट प्रवर्धन है कृत्रिम परिवेशीय।
पीसीआर विधि विकसित करने का विचार अमेरिकी शोधकर्ता कैरी मुलिस का है, जिन्होंने 1983 में एक ऐसी विधि बनाई, जिसने कृत्रिम परिस्थितियों में डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम का उपयोग करके चक्रीय दोहरीकरण के दौरान डीएनए को बढ़ाना संभव बना दिया। इस विचार के प्रकाशित होने के कुछ वर्षों बाद 1993 में के. मुलिस को इसके लिए नोबेल पुरस्कार मिला।
विधि का उपयोग करने की शुरुआत में, प्रत्येक हीटिंग-कूलिंग चक्र के बाद, डीएनए पोलीमरेज़ को प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ना आवश्यक था, क्योंकि यह जल्दी से निष्क्रिय हो गया था उच्च तापमान. प्रक्रिया बहुत अक्षम थी, जिसमें बहुत समय और एंजाइम की आवश्यकता होती थी। 1986 में, थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके इसे काफी संशोधित किया गया था। ये एंजाइम कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम हैं, जो आपको पीसीआर को स्वचालित करने की अनुमति देता है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ में से एक को बैक्टीरिया से अलग किया गया है। थर्मस जलीयऔर नाम दिया तक-डीएनए पोलीमरेज़।
विधि का सार।यह विधि एंजाइम टाक-डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक निश्चित डीएनए क्षेत्र की कई चयनात्मक नकल पर आधारित है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन से लंबाई में कई हज़ार बेस पेयर तक के एम्पलीफ़िकेशन प्राप्त करना संभव हो जाता है। पीसीआर उत्पाद की लंबाई को 20-40 हजार आधार जोड़े तक बढ़ाने के लिए, विभिन्न पोलीमरेज़ के मिश्रण का उपयोग किया जाता है, लेकिन यह अभी भी एक यूकेरियोटिक कोशिका के क्रोमोसोमल डीएनए की लंबाई से बहुत कम है।
प्रतिक्रिया एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टेट (एम्पलीफायर) में की जाती है - एक उपकरण जो काफी तेजी से प्रदर्शन कर सकता है
टेस्ट ट्यूबों को ठंडा और गर्म करना (आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ)। एम्पलीफायर आपको "हॉट स्टार्ट" और बाद के स्टोरेज की संभावना वाले जटिल प्रोग्राम सेट करने की अनुमति देते हैं। रीयल-टाइम पीसीआर के लिए, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से लैस उपकरणों का उत्पादन किया जाता है। उपकरण स्वचालित ढक्कन और माइक्रोप्लेट डिब्बे के साथ भी उपलब्ध हैं, जिससे उन्हें स्वचालित सिस्टम में एकीकृत किया जा सकता है।
आमतौर पर, पीसीआर के दौरान, 20-45 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग, बढ़ाव (चित्र। 6.1 और 6.2)। अंजीर पर। 6.1 पीसीआर चक्र के दौरान टेस्ट ट्यूब में तापमान परिवर्तन की गतिशीलता को दर्शाता है।
चावल। 6.1।पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के एक चक्र के दौरान टेस्ट ट्यूब में तापमान में बदलाव का ग्राफ
डीएनए टेम्पलेट विकृतीकरणप्रतिक्रिया मिश्रण को 5-90 एस के लिए 94-96 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके किया जाता है ताकि डीएनए श्रृंखला फैल जाए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पहले चक्र से पहले, प्रारंभिक मैट्रिक्स को पूरी तरह से विकृत करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को 2-5 मिनट के लिए पहले से गरम किया जाता है, जिससे गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा को कम करना संभव हो जाता है।
चावल। 6.2।पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के पहले चक्र की योजना
प्राइमर एनीलिंग चरण।तापमान में धीरे-धीरे कमी के साथ, प्राइमर पूरक रूप से टेम्पलेट से जुड़ते हैं। एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर परिकलित पिघलने के तापमान से 4-5 डिग्री सेल्सियस कम होता है। चरण की अवधि 5-60 एस है।
अगले चरण के दौरान- बढ़ाव- मातृ मैट्रिक्स पर डीएनए के बेटी स्ट्रैंड का संश्लेषण होता है। बढ़ाव तापमान पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले टाक और पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ 72 डिग्री सेल्सियस पर सबसे अधिक सक्रिय होते हैं। बढ़ाव का समय, मुख्य रूप से पीसीआर उत्पाद की लंबाई पर निर्भर करता है, आमतौर पर प्रति 1000 आधार जोड़े में 1 मिनट होता है।
एसईआई एचपीई "क्रास्नोयार्स्क स्टेट मेडिकल एकेडमी
यासेनेत्स्की के नाम पर रखा गया संघीय संस्थास्वास्थ्य और सामाजिक विकास के लिए »
मेडिकल जेनेटिक्स और क्लिनिकल न्यूरोफिज़ियोलॉजी विभाग, आईपीओ
विधि के मुख्य सिद्धांत
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
3-4 पाठ्यक्रमों के छात्रों के लिए विधायी मैनुअल
सामान्य चिकित्सा की विशिष्टताओं में (060101) और
क्रास्नोयार्स्क - 2007
श्नाइडर, एन.ए., बुत्यानोव, आर.ए. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि के मूल सिद्धांत। सामान्य चिकित्सा (060101) और बाल रोग (060103) की विशिष्टताओं में 3-4 पाठ्यक्रमों के छात्रों के पाठ्येतर कार्य के लिए कार्यप्रणाली मैनुअल। - क्रास्नोयार्स्क: GOU VPO KrasGMA का प्रकाशन गृह, 2007. - 42p।
मैनुअल पूरी तरह से राज्य मानक (2000) की आवश्यकताओं का अनुपालन करता है और वंशानुगत मानव रोगों के निदान के लिए आधुनिक पद्धति के मुख्य पहलुओं को दर्शाता है - पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि, शैक्षिक सामग्री को अनुकूलित किया गया है शैक्षिक प्रौद्योगिकियांचिकित्सा और बाल चिकित्सा संकायों के 3-4 पाठ्यक्रमों में प्रशिक्षण की बारीकियों को ध्यान में रखते हुए।
समीक्षक:चिकित्सा आनुवंशिकी विभाग के प्रमुख, उच्च व्यावसायिक शिक्षा के राज्य शैक्षिक संस्थान
"स्वास्थ्य और सामाजिक विकास के लिए संघीय एजेंसी के नोवोसिबिर्स्क स्टेट मेडिकल यूनिवर्सिटी", चिकित्सा विज्ञान के डॉक्टर, प्रोफेसर;
डी एन ए की नकल
इस पद्धति के अध्ययन का उद्देश्य डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) है। डीएनए पृथ्वी पर मौजूद सभी जीवों (आरएनए युक्त सूक्ष्मजीवों के अपवाद के साथ) में आनुवंशिक जानकारी का एक सार्वभौमिक वाहक है। डीएनए एक हेलिक्स में मुड़ा हुआ एक डबल स्ट्रैंड है। प्रत्येक स्ट्रैंड में श्रृंखला में जुड़े न्यूक्लियोटाइड होते हैं। डीएनए स्ट्रैंड्स की विपरीत दिशा होती है: एक स्ट्रैंड का 5'-एंड दूसरे स्ट्रैंड के 3'-एंड से मेल खाता है। डीएनए की अनूठी संपत्ति इसकी खुद को डुप्लिकेट करने की क्षमता है। यह प्रक्रिया कहलाती है प्रतिकृति. डीएनए अणु की प्रतिकृति इंटरपेज़ की सिंथेटिक अवधि के दौरान होती है। "माता-पिता" अणु की दो श्रृंखलाओं में से प्रत्येक "बेटी" के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करती है। प्रतिकृति के बाद, नए संश्लेषित डीएनए अणु में एक "मातृ" किनारा होता है, और दूसरा - एक "बेटी", नव संश्लेषित (अर्ध-रूढ़िवादी विधि)। एक नए डीएनए अणु के टेम्पलेट संश्लेषण के लिए, यह आवश्यक है कि पुराने अणु को वांछित और फैलाया जाए। प्रतिकृति डीएनए अणु में कई स्थानों पर शुरू होती है। एक डीएनए अणु की एक प्रतिकृति की शुरुआत से दूसरे की शुरुआत तक की धारा कहलाती है प्रतिकृति.
प्रतिकृति की शुरुआत सक्रिय है प्राइमरों(बीज), जिसमें 100-200 आधार जोड़े होते हैं। डीएनए हेलिकेज़ एंजाइम माता-पिता डीएनए हेलिक्स को दो स्ट्रैंड्स में खोल देता है और अलग कर देता है, जिस पर, पूरकता के सिद्धांत के अनुसार, डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की भागीदारी के साथ, "बेटी" डीएनए स्ट्रैंड्स को इकट्ठा किया जाता है। एंजाइम को अपना काम शुरू करने के लिए, एक शुरुआती ब्लॉक की उपस्थिति की आवश्यकता होती है - एक छोटा प्रारंभिक डबल-स्ट्रैंडेड टुकड़ा। शुरुआती ब्लॉक तब बनता है जब प्राइमर पैरेंट डीएनए के संबंधित स्ट्रैंड के पूरक क्षेत्र के साथ इंटरैक्ट करता है। प्रत्येक प्रतिकृति में, डीएनए पोलीमरेज़ "मदर" स्ट्रैंड के साथ केवल एक दिशा (5`=>3`) में स्थानांतरित हो सकता है।
अग्रणी स्ट्रैंड पर, जैसा कि प्रतिकृति खुलती है, एक "बेटी" स्ट्रैंड धीरे-धीरे लगातार बढ़ती है। लैगिंग स्ट्रैंड पर, बेटी स्ट्रैंड भी दिशा में संश्लेषित करती है (5`=>3`), लेकिन अलग-अलग टुकड़ों में जैसे ही प्रतिकृति खुलती है।
इस प्रकार, "बेटी" स्ट्रैंड्स के पूरक न्यूक्लियोटाइड्स का लगाव विपरीत दिशाओं (एंटीपैरल) में जाता है। सभी प्रतिकृतियों में प्रतिकृति एक साथ होती है। अलग-अलग प्रतिकृतियों में संश्लेषित "बेटी" किस्में के टुकड़े और कुछ हिस्सों को एक एंजाइम लिगेज द्वारा एक ही भूग्रस्त में जोड़ा जाता है। प्रतिकृति की विशेषता अर्ध-संरक्षण, विरोधी-समानता और असंतोष है। एक कोशिका के पूरे जीनोम को एक माइटोटिक चक्र के अनुसार प्रति समय एक बार दोहराया जाता है। प्रतिकृति प्रक्रिया के परिणामस्वरूप, एक डीएनए अणु से दो डीएनए अणु बनते हैं, जिसमें एक स्ट्रैंड मूल डीएनए अणु से होता है, और दूसरा, बेटी, नव संश्लेषित (चित्र 1) होता है।
चावल। एक। डीएनए अणु प्रतिकृति का आरेख।
इस प्रकार, डीएनए प्रतिकृति चक्र में शामिल हैं तीन मुख्य चरण:
1. डीएनए हेलिक्स को खोलना और स्ट्रैंड्स का विचलन (विकृतीकरण);
2. प्राइमरों का लगाव;
3. बाल धागे की श्रृंखला को पूरा करना।
पीसीआर विधि का सिद्धांत
यह डीएनए प्रतिकृति थी जिसने पीसीआर का आधार बनाया। पीसीआर में, ऊपर सूचीबद्ध प्रक्रियाओं को चक्रीय मोड में टेस्ट ट्यूब में किया जाता है। ऊष्मायन मिश्रण के तापमान को बदलकर प्रतिक्रिया के एक चरण से दूसरे चरण में संक्रमण प्राप्त किया जाता है। जब घोल को 93-95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है, तो डीएनए विकृतीकरण होता है। अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए - प्राइमरों को जोड़ना या "एनीलिंग" करना - ऊष्मायन मिश्रण को 50-65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है। इसके बाद, मिश्रण को 70-72 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है - टाक-डीएनए पोलीमरेज़ का इष्टतम संचालन - इस स्तर पर, एक नया डीएनए स्ट्रैंड पूरा हो जाता है। फिर चक्र फिर से दोहराता है। दूसरे शब्दों में पीसीआर विधि प्रतियों की संख्या में एक से अधिक वृद्धि है (विस्तारण) एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा उत्प्रेरित डीएनए का एक विशिष्ट खंड।
बेटी के डीएनए स्ट्रैंड का विस्तार मातृ डीएनए के दोनों स्ट्रैंड पर एक साथ होना चाहिए, इसलिए दूसरे स्ट्रैंड की प्रतिकृति के लिए भी अपने प्राइमर की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, दो प्राइमरों को प्रतिक्रिया मिश्रण में पेश किया जाता है: एक "+"-श्रृंखला के लिए, दूसरा "-"-श्रृंखला के लिए। डीएनए अणु के विपरीत किस्में में शामिल होने के बाद, प्राइमर खुद को इसके उस हिस्से तक सीमित कर लेते हैं, जिसे बाद में बार-बार दोगुना या प्रवर्धित किया जाएगा। ऐसे टुकड़े की लंबाई, जिसे एम्प्लिकॉन कहा जाता है, आमतौर पर कई सौ न्यूक्लियोटाइड्स होते हैं।
पीसीआर कदम
प्रत्येक प्रवर्धन चक्र में विभिन्न तापमान स्थितियों (चित्र 2) में होने वाली 3 अवस्थाएँ शामिल हैं।
· प्रथम चरण:डीएनए विकृतीकरण . यह 30-40 सेकंड के लिए 93-95° पर बहती है।
· चरण 2:प्राइमर एनीलिंग . प्राइमर अटैचमेंट एक विशिष्ट साइट की सीमाओं पर विपरीत डीएनए स्ट्रैंड्स पर संबंधित अनुक्रमों के पूरक होते हैं। प्राइमरों की प्रत्येक जोड़ी का अपना एनीलिंग तापमान होता है, जिसका मान 50-65 डिग्री सेल्सियस की सीमा में होता है। एनीलिंग समय 20-60 सेकंड।
· स्टेज 3:डीएनए श्रृंखलाओं का विस्तार। डीएनए श्रृंखलाओं का पूरक विस्तार श्रृंखला के 5" छोर से 3" छोर तक विपरीत दिशाओं में होता है, जो प्राइमर अटैचमेंट साइटों से शुरू होता है। नए डीएनए स्ट्रैंड्स के संश्लेषण के लिए सामग्री डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट हैं जो समाधान में जोड़े जाते हैं। संश्लेषण प्रक्रिया एंजाइम टाक-पोलीमरेज़ द्वारा उत्प्रेरित होती है और 70-72 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर होती है। संश्लेषण समय - 20-40 सेकंड।
पहले प्रवर्धन चक्र में गठित नए डीएनए स्ट्रैंड दूसरे प्रवर्धन चक्र के लिए टेम्प्लेट के रूप में काम करते हैं, जिसमें एक विशिष्ट एम्प्लिकॉन डीएनए टुकड़ा बनता है (चित्र 3)। बाद के प्रवर्धन चक्रों में, एम्पलीकॉन्स नई श्रृंखलाओं के संश्लेषण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करते हैं।
इस प्रकार, सूत्र 2" के अनुसार एक घोल में एम्पलीकॉन्स का संचय होता है, जहाँ n प्रवर्धन चक्रों की संख्या है। इसलिए, भले ही प्रारंभिक समाधान में केवल एक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणु शुरू में था, फिर भी लगभग 108 एम्प्लिकॉन अणु 30-40 चक्रों में समाधान में जमा करें यह राशि agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इस टुकड़े के विश्वसनीय दृश्य पहचान के लिए पर्याप्त है।
प्रवर्धन प्रक्रिया एक विशेष प्रोग्राम योग्य थर्मोस्टेट में की जाती है ( साइक्लर), जो किसी दिए गए कार्यक्रम के अनुसार, स्वचालित रूप से प्रवर्धन चक्रों की संख्या के अनुसार तापमान में परिवर्तन करता है।
प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता होती है:
· डीएनए टेम्पलेट(डीएनए या उसका हिस्सा जिसमें वांछित विशिष्ट टुकड़ा है);
· प्राइमरों(सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (20-30 न्यूक्लियोटाइड जोड़े) निर्धारित किए जा रहे विशिष्ट टुकड़े की सीमाओं पर डीएनए अनुक्रमों के पूरक हैं)। एक विशिष्ट टुकड़े का चुनाव और प्राइमरों का चयन प्रवर्धन की विशिष्टता में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, जो विश्लेषण की गुणवत्ता को प्रभावित करता है।
· डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (dNTPs) का मिश्रण(चार dNTPs का मिश्रण, जो 200-500 माइक्रोन के समतुल्य सांद्रता में नए पूरक डीएनए स्ट्रैंड के संश्लेषण के लिए सामग्री हैं)
· एनजाइमतक-पोलीमरेज़(थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़, संश्लेषित डीएनए, 2-3 मिमी की बढ़ती श्रृंखला के लिए न्यूक्लियोटाइड आधारों के अनुक्रमिक जोड़ द्वारा प्राइमर श्रृंखलाओं को लंबा करने के लिए उत्प्रेरित करता है)।
· उभयरोधी घोल(प्रतिक्रिया माध्यम जिसमें Mg2+ आयन एंजाइम गतिविधि को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, PH 6.8-7.8)।
आरएनए वायरस के जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए, एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस) द्वारा उत्प्रेरित रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) प्रतिक्रिया का उपयोग करके आरएनए टेम्पलेट से एक डीएनए कॉपी पहले प्राप्त की जाती है।
चावल। 2. प्रवर्धन (पहला चक्र)।
चावल। 3. प्रवर्धन (दूसरा चक्र)।
पीसीआर के मुख्य अनुप्रयोग
नैदानिक दवा:
ओ संक्रमण का निदान,
o म्यूटेशन का पता लगाना, वंशानुगत बीमारियों के निदान सहित,
ओ जीनोटाइपिंग, एचएलए जीनोटाइपिंग सहित,
ओ सेलुलर प्रौद्योगिकियों
पारिस्थितिकी (पर्यावरणीय वस्तुओं और भोजन की स्थिति और गुणवत्ता की निगरानी के तरीके के रूप में)
ट्रांसजेनिक जीवों की परिभाषा (जीएमओ)
व्यक्तिगत पहचान, पितृत्व, फोरेंसिक
सामान्य और विशेष जीव विज्ञान,
बुनियादी सिद्धांत
नैदानिक प्रयोगशालाओं का संगठन
पीसीआर प्रयोगशाला में काम "स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के सैनिटरी और महामारी विज्ञान संस्थानों के प्रयोगशालाओं (विभागों, विभागों) में काम करते समय डिजाइन, सुरक्षा, औद्योगिक स्वच्छता, महामारी विरोधी शासन और व्यक्तिगत स्वच्छता के नियमों के अनुसार किया जाता है।
डीएनए नमूनों का संदूषण
पीसीआर डायग्नोस्टिक्स का संचालन विधि की उच्च संवेदनशीलता के कारण होने वाली समस्या से जुड़ा है - संभावना दूषण। प्रतिक्रिया ट्यूब में सकारात्मक डीएनए की ट्रेस मात्रा का प्रवेश (विशिष्ट डीएनए प्रवर्धन उत्पाद - एम्पलीकॉन; डीएनए मानक एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है; एक नैदानिक नमूने का सकारात्मक डीएनए) पीसीआर के दौरान एक विशिष्ट डीएनए टुकड़े के प्रवर्धन की ओर जाता है और, परिणामस्वरूप , उपस्थिति के लिए झूठे सकारात्मक परिणाम.
काम के सिलसिले में आपकी मुलाकात हो सकती है दो प्रकार के संदूषण:
1. पार संदूषणनमूने से नमूने तक (नैदानिक नमूनों के प्रसंस्करण के दौरान या प्रतिक्रिया मिश्रण को खोदते समय), छिटपुट झूठे सकारात्मक परिणामों की उपस्थिति के लिए अग्रणी;
2. प्रवर्धन उत्पाद संदूषण(amplicons) होने उच्चतम मूल्य, क्योंकि पीसीआर प्रक्रिया के दौरान, एम्पलीकॉन भारी मात्रा में जमा होते हैं और पुन: प्रवर्धन के लिए आदर्श उत्पाद होते हैं।
व्यंजन, स्वचालित पिपेट और प्रयोगशाला उपकरण, प्रयोगशाला तालिकाओं की सतह, या यहां तक कि प्रयोगशाला श्रमिकों की त्वचा की सतह का ट्रेस एम्प्लिकॉन संदूषण व्यवस्थित झूठे सकारात्मक परिणामों की उपस्थिति की ओर जाता है। संदूषण के स्रोत का निर्धारण करना बहुत कठिन हो सकता है और इसके लिए समय और धन के महत्वपूर्ण निवेश की आवश्यकता होती है। निदान के लिए पीसीआर पद्धति का उपयोग करके प्रयोगशालाओं के काम में जमा हुआ अनुभव हमें ऐसी प्रयोगशालाओं के संगठन के लिए बुनियादी आवश्यकताओं को तैयार करने और स्वयं विश्लेषण करने की अनुमति देता है। इन आवश्यकताओं के अनुपालन से संदूषण और गलत सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने की संभावना समाप्त हो जाती है।
पीसीआर विश्लेषण के चरण
भौगोलिक रूप से अलग, उन्हें अलग-अलग कमरों में रखकर (चित्र 4.5):
· प्री-पीसीआर रूम,जहां नैदानिक नमूनों का प्रसंस्करण, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर और पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी की जाती है (यदि स्थितियां उपलब्ध हैं, तो अंतिम दो चरणों को एक अतिरिक्त अलग कमरे में करने की भी सिफारिश की जाती है)। इन कमरों में अध्ययन किए गए एजेंटों के साथ अन्य सभी प्रकार के काम करने की मनाही है, जिनके पीसीआर डायग्नोस्टिक्स इस प्रयोगशाला में किए जाते हैं।
· पोस्ट-पीसीआर कक्ष,जहां प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाया जाता है। इस कमरे में अन्य पहचान विधियों का उपयोग किया जा सकता है। प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाने के लिए जहां तक संभव हो पूर्व-पीसीआर कक्षों से कमरे का पता लगाना वांछनीय है।
कार्य कक्ष 2.5 W प्रति 1 m3 की दर से 260 एनएम (प्रकार DB-60) के क्षेत्र में अधिकतम विकिरण वाले पराबैंगनी लैंप से सुसज्जित हैं। लैंप स्थित हैं ताकि काम की मेज, उपकरण और सामग्री की सतहें जिनके साथ पीसीआर विश्लेषण के दौरान ऑपरेटर संपर्क में आता है, सीधे विकिरण के संपर्क में आते हैं। काम शुरू होने से 1 घंटे पहले और काम खत्म होने के 1 घंटे के भीतर विकिरण किया जाता है।
प्रयोगशाला के डॉक्टर विशेष प्रयोगशाला के कपड़ों में काम करते हैं, जो एक कमरे से दूसरे कमरे में जाने पर और डिस्पोजेबल दस्ताने में बदलते हैं। अलग-अलग कमरों के कपड़ों की प्रोसेसिंग अलग-अलग की जाती है। विभिन्न कर्मचारी पीसीआर विश्लेषण के विभिन्न चरणों में कार्य करते हैं।
काम के लिए, डिस्पेंसर, प्लास्टिक और कांच के बने पदार्थ, प्रयोगशाला के उपकरण, गाउन और दस्ताने के अलग-अलग सेट का उपयोग किया जाता है, जो विश्लेषण के विभिन्न चरणों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और एक कमरे से दूसरे कमरे में पोर्टेबल नहीं हैं। प्रत्येक कमरे में उपकरण, सामग्री और सूची को तदनुसार लेबल किया गया है।
काम के सभी चरण केवल डिस्पोजेबल उपभोग्य सामग्रियों के उपयोग के साथ किए जाते हैं: स्वचालित पिपेट, टेस्ट ट्यूब, दस्ताने इत्यादि के लिए सुझाव। नमूने से नमूने में जाने पर युक्तियों को बदलना सुनिश्चित करें। समाधान के माइक्रोड्रॉपलेट्स को पिपेट में प्रवेश करने से रोकने के लिए एरोसोल बैरियर फिल्टर के साथ युक्तियों का उपयोग करना आवश्यक है। प्रयुक्त टेस्ट ट्यूब और युक्तियों को विशेष कंटेनरों या कंटेनरों में एक कीटाणुनाशक समाधान के साथ छोड़ दिया जाता है। नैदानिक नमूने अभिकर्मकों से अलग रखे जाते हैं।
कार्यस्थल को संसाधित करने और साफ करने के लिए, प्रत्येक कमरे में कपास-धुंध स्वैब (नैपकिन), चिमटी, कीटाणुनाशक और निष्क्रिय करने वाले घोल हैं।
पीसीआर डायग्नोस्टिक प्रयोगशाला में, इस प्रयोगशाला में निदान किए गए रोगजनकों के डीएनए अनुक्रमों या जीन टुकड़ों वाले पुनः संयोजक प्लास्मिड के उत्पादन (क्लोनिंग) और अलगाव से संबंधित कार्य को बाहर रखा गया है।
नैदानिक सामग्री का संग्रह
पीसीआर के लिए अध्ययन की गई सामग्री उपकला कोशिकाओं, रक्त, प्लाज्मा, सीरम, फुफ्फुस और मस्तिष्कमेरु द्रव, मूत्र, थूक, बलगम और अन्य जैविक स्राव, बायोप्सी नमूनों के स्क्रैपिंग हो सकते हैं।
सामग्री का नमूना संबंधित प्रोफाइल के उपचार कक्ष की स्थितियों में किया जाता है। सैंपल लेने के बाद सैंपल को जल्द से जल्द पीसीआर डायग्नोस्टिक लेबोरेटरी ले जाना चाहिए।
सैंपलिंग केवल बाँझ, अधिमानतः डिस्पोजेबल, उपकरणों का उपयोग केवल डिस्पोजेबल बाँझ प्लास्टिक ट्यूब या ग्लास ट्यूब में किया जाना चाहिए, क्रोमियम मिश्रण के साथ एक घंटे के लिए पूर्व-उपचार किया जाता है, आसुत जल से अच्छी तरह से धोया जाता है और 150 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ओवन में कैल्सीन किया जाता है। 1 घंटे के लिए।
डिटेक्शन ज़ोन (दूसरी मंजिल या दूसरी इमारत)।
चावल। चार। वैद्युतकणसंचलन द्वारा पता लगाने के साथ पीसीआर प्रयोगशाला उपकरण।
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डिटेक्शन ज़ोन (अलग मंजिल या इमारत)
चावल। 5. फ्लोरोसेंट डिटेक्शन (मात्रात्मक विश्लेषण) के साथ पीसीआर प्रयोगशाला उपकरण।
चावल। 6. डीएनए निष्कर्षण कक्ष।दिखाया गया एक टेबलटॉप बॉक्स है जिसमें एक जीवाणुनाशक दीपक है।
चावल। 7. प्रवर्धन कक्ष।
चावल। आठ। जांच कक्ष।
चावल। 9. वंशानुगत रोगों के डीएनए निदान के लिए रक्त के नमूने.
नमूनों का भंडारण और परिवहन
वंशानुगत रोगों के निदान के लिए, रक्त के नमूनों को लंबे समय तक जमे हुए अवस्था में विशेष कागज के रूपों या एपिंडोर्फ्स (प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब) में संग्रहीत किया जाता है (चित्र 9)।
निदान के लिए संक्रामक रोगनमूने कमरे के तापमान पर 2 घंटे से अधिक नहीं हैं। यदि लंबे समय तक भंडारण की आवश्यकता होती है, तो नमूनों को रेफ्रिजरेटर में 2-8 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 24 घंटे से अधिक की अवधि के लिए रखा जा सकता है। माइनस 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर फ्रीज़र में जमे हुए होने पर लंबे समय तक भंडारण (2 सप्ताह तक) स्वीकार्य है। नमूनों के बार-बार जमने-गलने की अनुमति नहीं है।
यदि पीसीआर डायग्नोस्टिक प्रयोगशाला और सैंपलिंग के लिए प्रक्रिया कक्ष को क्षेत्रीय रूप से अलग किया जाता है, तो नमूनों को भंडारण के नियमों और संक्रामक सामग्री के परिवहन के नियमों के अनुपालन में नमूनों को थर्मोज या थर्मल कंटेनरों में ले जाया जाना चाहिए।
नमूनों से डीएनए का निष्कर्षण
सॉलिड-फेज सॉर्प्शन की विधि, जिसमें गुआनिडाइन के घोल से युक्त लाइसिंग एजेंट को जोड़ना, सॉर्बेंट पर डीएनए का सोरबेंट, बार-बार धोना और बफर सॉल्यूशन के साथ डीएनए का पुनर्जीवन शामिल है, व्यापक हो गया है। सीरम, प्लाज्मा या संपूर्ण रक्त प्रसंस्करण के मामले में, आमतौर पर फेनोलिक निष्कर्षण विधि का उपयोग किया जाता है। विधि में फिनोल/क्लोरोफॉर्म के साथ डीप्रोटिनाइजेशन शामिल है, जिसके बाद इथेनॉल या इसोप्रोपेनॉल के साथ डीएनए (या आरएनए) की वर्षा होती है। 1.5 मिली की मात्रा के साथ एपपेंडोर पी प्रकार के माइक्रोसेंट्रीफ्यूज टेस्ट ट्यूब में प्रसंस्करण किया जाता है। प्रसंस्करण समय 1.5-2 घंटे (चित्र 10) है।
चावल। दस। डीएनए का अलगाव।
पीसीआर का संचालन
प्रसंस्कृत क्लिनिकल नमूने से नमूने की एक निश्चित मात्रा को 0.2 या 0.5 मिलीलीटर की मात्रा के साथ एक विशेष एपपेंडोर्फ टाइप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। पानी, पीसीआर बफर, डीएनटीपी समाधान, प्राइमर समाधान और समाधान से मिलकर एक प्रवर्धन मिश्रण जोड़ा जाता है। एक ही ट्यूब Taq-पोलीमरेज़ (मिश्रण में अंतिम जोड़ा गया) आमतौर पर, प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा 25 μl है, फिर प्रवर्धन के दौरान प्रतिक्रिया मिश्रण के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक ट्यूब में खनिज तेल की एक बूंद डाली जाती है। एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टेट (एम्पलीफायर), जहां प्रवर्धन किसी दिए गए प्रोग्राम (चित्र 11) के अनुसार स्वचालित मोड में किया जाता है।
चावल। ग्यारह। एम्पलीफायर " thermocycler ».
दिए गए कार्यक्रम के आधार पर प्रतिक्रिया समय 2-3 घंटे है। प्रायोगिक नमूनों के समानांतर, नियंत्रण नमूने रखे जाते हैं: सकारात्मक नियंत्रण में प्रतिक्रिया के सभी घटक शामिल होते हैं, लेकिन नैदानिक नमूने की सामग्री के बजाय, अध्ययन के तहत जीन की एक नियंत्रण डीएनए तैयारी शुरू की जाती है। नकारात्मक नियंत्रण में प्रतिक्रिया के सभी घटक शामिल होते हैं, लेकिन नैदानिक सामग्री या डीएनए की तैयारी के बजाय, उचित मात्रा में विआयनीकृत पानी या एक अर्क जिसमें अध्ययन किए गए डीएनए शामिल नहीं होते हैं, जोड़ा जाता है। संदूषण के कारण उनमें डीएनए की अनुपस्थिति के लिए प्रतिक्रिया के घटकों की जांच करने और झूठे सकारात्मक परिणामों को बाहर करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण आवश्यक है।
परिणामों का पंजीकरण
एथिडियम ब्रोमाइड की उपस्थिति में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रवर्धित विशिष्ट डीएनए खंड का पता लगाया जाता है। एथिडियम ब्रोमाइड डीएनए टुकड़ों के साथ एक स्थिर अंतरालीय यौगिक बनाता है, जो चमकदार बैंड के रूप में प्रकट होता है जब जेल को यूवी विकिरण के साथ 290-330 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ विकिरणित किया जाता है। परिणामी पीसीआर एम्पलीकॉन्स के आकार के आधार पर, 1.5% से 2.5% agarose युक्त जेल का उपयोग किया जाता है। एगरोज जेल तैयार करने के लिए एगरोज, बफर और पानी के मिश्रण को माइक्रोवेव ओवन या पानी के स्नान में पिघलाया जाता है और एथिडियम ब्रोमाइड का घोल डाला जाता है। 50-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, मिश्रण को 4-6 मिमी मोटी परत के साथ मोल्ड में डाला जाता है, और विशेष कंघी का उपयोग करके, नमूना लगाने के लिए जेल में जेब बनाई जाती है। कंघी सेट कर रहे हैं ताकि कुओं के नीचे और जेल के आधार के बीच agarose 0.5-1 मिमी की एक परत बनी रहे। जेल के सख्त हो जाने के बाद, 5-15 μl की मात्रा में जेब पर एक एम्पलीकेट लगाया जाता है। नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के साथ समानांतर में डीएनए टुकड़ा लंबाई मार्करों के मिश्रण के वैद्युतकणसंचलन को करने की सिफारिश की जाती है। आमतौर पर, इस तरह के मिश्रण में डीएनए के दस टुकड़े 100, 200, 300 आदि लंबे आधार जोड़े होते हैं।
ऐसा नमूना सेट करने से आप नियंत्रण और प्रायोगिक नमूनों में एम्पलीकॉन्स की लंबाई को सत्यापित कर सकते हैं। लागू नमूने के साथ जेल को एक बफर से भरे वैद्युतकणसंचलन कक्ष में स्थानांतरित किया जाता है, कक्ष एक शक्ति स्रोत से जुड़ा होता है और प्रवर्धन उत्पादों का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण 10-15 के विद्युत क्षेत्र की ताकत पर 30-45 मिनट के लिए किया जाता है। वी / सेमी। इस मामले में, डाई के सामने, जो प्रतिक्रिया मिश्रण का हिस्सा है, को कम से कम 3 सेमी पास होना चाहिए।
वैद्युतकणसंचलन की समाप्ति के बाद, जेल को ट्रांसिल्यूमिनेटर ग्लास में स्थानांतरित किया जाता है और पराबैंगनी प्रकाश में देखा जाता है। दस्तावेज़ीकरण के लिए, जेल को मिक्रात 300 फिल्म पर चित्रित किया गया है या कंप्यूटर से जुड़े वीडियो सिस्टम का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया है।
नियंत्रण नमूनों का पहले मूल्यांकन किया जाता है। इलेक्ट्रोफोरेटिक लेन में सकारात्मक नियंत्रण के अनुरूप, एक नारंगी चमकदार बैंड मौजूद होना चाहिए। इसकी इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता निर्देशों में निर्दिष्ट एम्प्लिकॉन की लंबाई के अनुरूप होनी चाहिए।
इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रैक में नकारात्मक नियंत्रण के अनुरूप, ऐसा बैंड अनुपस्थित होना चाहिए। नकारात्मक नियंत्रण में इस तरह के एक बैंड की उपस्थिति संदूषण को इंगित करती है - अध्ययन किए गए डीएनए या एम्प्लिकॉन के साथ उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों का संदूषण। परीक्षण के नमूनों का मूल्यांकन एक बैंड की संबंधित लेन में उपस्थिति द्वारा किया जाता है जो सकारात्मक नियंत्रण नमूने में बैंड के समान स्तर पर स्थित होता है। बैंड की चमक की तीव्रता नमूने में अध्ययन के तहत डीएनए की मात्रा से मेल खाती है, जो पीसीआर के अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है। आमतौर पर सकारात्मक नतीजेचार-बिंदु पैमाने पर मूल्यांकन किया गया। यदि प्रायोगिक नमूने में बैंड की चमक बहुत कमजोर है, तो ऐसे नमूने को पुनर्व्यवस्थित किया जाना चाहिए (चित्र 12)।
चावल। 12. agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन।
पीसीआर के लिए आवेदनबिंदु उत्परिवर्तन और जीन बहुरूपता का निदान
व्यावहारिक स्वास्थ्य देखभाल में पीसीआर के आवेदन के प्रमुख क्षेत्रों में से एक बिंदु उत्परिवर्तन और जीन बहुरूपताओं का निदान है। . डीएनए डायग्नोस्टिक्स के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीके हैं। उन स्थितियों में जहां एक जीन ज्ञात है, जिसके नुकसान से वंशानुगत बीमारी का विकास होता है, आणविक आनुवंशिक विधियों द्वारा इस क्षति का पता लगाया जा सकता है। ऐसी विधियों को प्रत्यक्ष कहा जाता है। प्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग करते हुए, डीएनए के प्राथमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (म्यूटेशन और उनके प्रकार) में गड़बड़ी का पता लगाया जाता है। प्रत्यक्ष विधियों की विशेषता लगभग 100% सटीकता तक पहुँचना है।
हालाँकि, व्यवहार में, इन विधियों को कुछ शर्तों के तहत लागू किया जा सकता है।:
वंशानुगत बीमारी के विकास के लिए जिम्मेदार जीन के ज्ञात साइटोजेनेटिक स्थानीयकरण के साथ;
रोग जीन को क्लोन किया जाना चाहिए और इसके न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को जाना जाना चाहिए।
प्रत्यक्ष डीएनए डायग्नोस्टिक्स का लक्ष्य उत्परिवर्ती एलील्स की पहचान करना है।
इस प्रकार, उन स्थितियों में जहां यह ज्ञात होता है कि किस प्रकार के डीएनए की क्षति एक वंशानुगत बीमारी की ओर ले जाती है, क्षति वाले डीएनए के टुकड़े की सीधे जांच की जाती है, अर्थात, डीएनए डायग्नोस्टिक्स की प्रत्यक्ष विधि का उपयोग किया जाता है।
हालाँकि, आज तक, कई रोगों के जीनों की मैपिंग नहीं की गई है, उनका एक्सॉन-इंट्रॉन संगठन अज्ञात है, और कई वंशानुगत रोगों को स्पष्ट आनुवंशिक विषमता की विशेषता है, जो प्रत्यक्ष डीएनए निदान विधियों के पूर्ण उपयोग की अनुमति नहीं देता है। इसलिए, ऐसे मामलों में जहां क्षति का स्थानीयकरण ज्ञात नहीं है, एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है, जीन रोग के लिए जिम्मेदार जीन के आसपास के अध्ययन से जुड़ा हुआ है, पारिवारिक विश्लेषण के संयोजन में, यानी आणविक आनुवंशिक निदान के अप्रत्यक्ष तरीके वंशानुगत रोगों का उपयोग किया जाता है।
प्वाइंट म्यूटेशन और छोटे विलोपन का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ये सभी पीसीआर पद्धति के उपयोग पर आधारित हैं। यह प्रतिक्रिया आपको डीएनए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को बार-बार गुणा करने और फिर उत्परिवर्तनों की खोज करने की अनुमति देती है। उत्परिवर्तन वाले डीएनए अंशों की खोज के तरीके उत्परिवर्ती और सामान्य डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के तुलनात्मक विश्लेषण पर आधारित हैं।
पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण
प्रत्यक्ष डीएनए निदान की प्रक्रिया में
इसमें जीन के प्रवर्धित क्षेत्र की विशिष्ट विशेषताओं का अध्ययन शामिल है। इस प्रकार, ट्राइन्यूक्लियोटाइड रिपीट के विस्तार के कारण होने वाली बीमारियों में, प्रवर्धन उत्पाद उनकी लंबाई में भिन्न होते हैं (अध्ययन किए गए जीन क्षेत्र में ट्रिपल की एक अलग संख्या को दर्शाते हैं) और, परिणामस्वरूप, जेल में उनकी गति की गति में। इसके कारण, सामान्य और उत्परिवर्ती युग्मविकल्पियों का एक स्पष्ट इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और रोगात्मक रूप से बढ़े हुए टुकड़े का एक सटीक निर्धारण, यानी रोग का डीएनए निदान (चित्र। 13), प्राप्त किया जाता है।
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चावल। चौदह। विलोपन का निदान झूठ जीन में डीवाईटी डोपा-स्वतंत्र डायस्टोनिया (पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन) वाले रोगियों में 1। ट्रैक 2,3,6 - बीमार; लेन 1,4,5 - नियंत्रण। पतला तीर सामान्य एलील को इंगित करता है, बोल्ड एरो म्यूटेंट शॉर्ट एलील (तीन न्यूक्लियोटाइड्स को हटाना) को इंगित करता है।
यदि अध्ययन के तहत डीएनए क्षेत्र पूरी तरह से एक विस्तारित विलोपन में शामिल है, तो प्राइमर संकरण के लिए स्थानों की कमी के कारण इस हटाए गए एलील से डीएनए का पीसीआर प्रवर्धन नहीं किया जाएगा। इस मामले में, प्रतिक्रिया के पीसीआर उत्पाद की पूर्ण अनुपस्थिति के आधार पर एक समरूप विलोपन का निदान किया जाएगा (डीएनए संश्लेषण जीन की दोनों प्रतियों से असंभव है)। एक विषमयुग्मजी विलोपन के साथ, एक सामान्य (सुरक्षित) एलील से संश्लेषित एक पीसीआर उत्पाद का पता लगाना संभव है, हालांकि, इस तरह के उत्परिवर्तन के विश्वसनीय निदान के लिए, अधिक परिष्कृत डीएनए विज़ुअलाइज़ेशन विधियों का उपयोग करना आवश्यक है जो अंतिम की खुराक का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। पीसीआर उत्पाद।
कुछ साइटों पर पॉइंट म्यूटेशन (अक्सर न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन) का पता लगाने के लिए, पीसीआर विधि का उपयोग आणविक आनुवंशिक विश्लेषण के अन्य तरीकों के संयोजन में किया जाता है। यदि प्रस्तावित बिंदु उत्परिवर्तन का स्थान और प्रकृति ठीक से ज्ञात है, तो ऐसे उत्परिवर्तन के उद्देश्यपूर्ण पता लगाने के लिए, प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस (प्रतिबंधित करता है) बैक्टीरिया के विभिन्न उपभेदों से पृथक विशेष कोशिकीय एंजाइम हैं।
ये एंजाइम लंबाई में चार से दस न्यूक्लियोटाइड तक के विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को पहचानते हैं। फिर वे एक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणु के हिस्से के रूप में इन अनुक्रमों के प्रतिबंध (लेट। (काटने) को अंजाम देते हैं। प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम एक निश्चित स्थान पर एक निश्चित रूप से परिभाषित, विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पहचानता है और काटता है - प्रतिबंध स्थल (मान्यता स्थल)।
ऐसे मामलों में जहां एक बिंदु उत्परिवर्तन एक विशेष प्रतिबंध एंजाइम के लिए मान्यता की प्राकृतिक साइट को बदल देता है, वह एंजाइम उत्परिवर्ती पीसीआर-प्रवर्धित टुकड़े को साफ करने में सक्षम नहीं होगा। कुछ मामलों में, उत्परिवर्तन एक विशेष प्रतिबंध एंजाइम के लिए एक नई मान्यता साइट की उपस्थिति की ओर जाता है, जो आदर्श में अनुपस्थित है।
दोनों स्थितियों में, चयनित प्रतिबंध एंजाइम के साथ इलाज किए गए उत्परिवर्ती और सामान्य पीसीआर उत्पाद अलग-अलग लंबाई के प्रतिबंध टुकड़े देंगे, जिन्हें वैद्युतकणसंचलन (चित्र 15) द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है।
इस प्रकार, यदि किसी विशेष बिंदु उत्परिवर्तन का शीघ्रता से पता लगाना आवश्यक है, तो कार्य को संबंधित प्रतिबंध एंजाइम की खोज के लिए कम कर दिया जाता है, जिसकी मान्यता साइट अशांत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के स्थल पर स्थानीयकृत होती है। इस प्रतिबंध एंजाइम के साथ पीसीआर उत्पादों का उपचार सामान्य और उत्परिवर्ती एलील्स के आसान भेदभाव की अनुमति देगा। प्रतिबंध विश्लेषण ज्ञात बिंदु म्यूटेशन का पता लगाने को बहुत सरल करता है और वर्तमान में वंशानुगत रोगों के प्रत्यक्ष डीएनए निदान के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
अंतिम चरण उत्परिवर्तन का आणविक आनुवंशिक विश्लेषणअध्ययन किए गए डीएनए टुकड़े (अनुक्रमण) के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का निर्धारण है, जिसकी तुलना आदर्श से की जाती है और अंतिम आनुवंशिक निदान तैयार किया जाता है। आणविक आनुवंशिकी में प्रगति के लिए धन्यवाद, अब 400 से अधिक वंशानुगत रोगों के लिए डीएनए निदान विधियों का विकास किया गया है।
चावल। पंद्रह। प्रतिबंध विश्लेषण का उपयोग करके एक बिंदु उत्परिवर्तन का पता लगाना:ए - प्रतिबंध साइट वाले जीन का प्रवर्धित क्षेत्रएजीसीटीप्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज के लिएआलू मैं. उत्परिवर्तनजी→ एइस न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को बदलता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिबंध एंजाइम होता हैअलुईअवरुद्ध; बी - प्रतिबंध उत्पादों का इलेक्ट्रोफेरोग्राम: लेन 1 - सामान्य एलील के लिए समरूपता; लेन 2, उत्परिवर्तन के लिए समरूपता; लेन 3 - विषम अवस्था (सामान्य एलील + म्यूटेशन)।
रोगियों, उनके परिवार के सदस्यों या पैथोलॉजिकल म्यूटेशन के प्रकल्पित विषमयुग्मजी वाहकों में उत्परिवर्ती एलील की प्रत्यक्ष परीक्षा के आधार पर वंशानुगत रोगों का निदान पूर्व-लक्षणात्मक और प्रसव पूर्व निदान के लिए उपयुक्त है, जिसे सबसे अधिक लागू किया जा सकता है। प्रारंभिक चरणरोग के किसी भी नैदानिक या जैव रासायनिक लक्षणों के प्रकट होने से पहले भ्रूण का विकास।
उत्परिवर्तन का पता लगाने की विधि के बावजूद, प्रत्येक उत्परिवर्तन का सटीक आणविक लक्षण वर्णन केवल प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। में इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए पिछले साल काविशेष उपकरणों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है - सीक्वेंसर, जो डीएनए जानकारी पढ़ने की प्रक्रिया को काफी तेज करना संभव बनाता है।
क्लिनिकल डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाओं में आणविक जैविक अनुसंधान के व्यापक अनुप्रयोग का रास्ता एक निरंतरता में सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करके, नमूना हस्तांतरण के बिना, कई एनालिटिक्स के समानांतर परीक्षण के दौरान संदूषण को रोकने के लिए और उद्देश्य पंजीकरण के साथ संदूषण को रोकने के लिए विश्लेषणात्मक प्रक्रिया को तेज करके खोला गया है। प्रत्येक चक्र में परिणामों की।
पीसीआर पद्धति के मुख्य संशोधन
ज्ञात जीन म्यूटेशनों को जल्दी से स्कैन करने और खोजने के लिए उपयोग किया जाता है।
मल्टीप्लेक्स (मल्टीप्राइमर) पीसीआर
यह विधि एक प्रतिक्रिया में अध्ययन किए गए जीन के कई एक्सॉन के एक साथ प्रवर्धन पर आधारित है। यह सबसे आम म्यूटेशनों की किफायती तेजी से जांच की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, प्रगतिशील ड्यूकेन/बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी वाले रोगियों में डायस्ट्रोफिन जीन में विलोपन के कैरिज का शीघ्र निदान करने के लिए, इस जीन के सबसे अक्सर उत्परिवर्तित एक्सॉन के सेट का एक साथ प्रवर्धन किया जाता है। चूँकि ये रोग एक एक्स-लिंक्ड रिसेसिव प्रकार में विरासत में मिले हैं और लड़कों में केवल एक्स क्रोमोसोम को नुकसान पहुँचाते हैं, एक विस्तारित विलोपन के मामले में, प्रतिक्रिया उत्पादों के वैद्युतकणसंचलन से एक या एक से अधिक डीएनए अंशों (एक्सॉन) की अनुपस्थिति का पता चलेगा। ), जो निदान की आणविक पुष्टि के रूप में काम कर सकता है। इसके अलावा, पीसीआर प्रवर्धन के लिए विशिष्ट जीन क्षेत्रों का चयन करके, विलोपन की कुल लंबाई और जीन ब्रेक पॉइंट (एक्सॉन तक) का काफी सटीक आकलन संभव है।
कई मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के संयुक्त उपयोग से 98% तक सभी विलोपन का निदान करना संभव हो जाता है जो प्रगतिशील ड्यूकेन / बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी वाले रोगियों में होता है। यह डायस्ट्रोफिन जीन में ज्ञात म्यूटेशनों की कुल संख्या का लगभग 60% है और डायस्ट्रोफिनोपैथी (चित्र 16) के डीएनए निदान के लिए इस स्क्रीनिंग विधि की बहुत उच्च दक्षता का संकेत देता है।
चावल। 16. मल्टीप्लेक्स पीसीआर (एग्रोसे जेल वैद्युतकणसंचलन) का उपयोग करके ड्यूकेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी का प्रत्यक्ष डीएनए निदान। प्रत्येक परीक्षित व्यक्तियों में, डायस्ट्रोफिन जीन के चार एक्सॉन एक साथ प्रवर्धित किए गए थे (एक्सॉन 17, 19, 44, और 45; तीर संबंधित प्रवर्धन उत्पादों को इंगित करते हैं)। लेन 1 - नियंत्रण, गलियां 2-5 - डायस्ट्रोफिन जीन के विभिन्न विलोपन के साथ ड्यूकेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी वाले रोगी (गलियां 2 और 5 - एक्सॉन 45 को हटाना, लेन 3 - एक्सॉन 44 को हटाना, लेन 4 - एक्सॉन 17 और 19 को हटाना ).
एलील-विशिष्ट प्रवर्धन
विधि जीन के एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए प्राइमरों के दो स्वतंत्र जोड़े के उपयोग पर आधारित है: दोनों जोड़े में एक प्राइमर आम है, और प्रत्येक जोड़ी में दूसरे प्राइमर की एक अलग संरचना होती है और यह एक सामान्य या उत्परिवर्ती डीएनए का पूरक होता है। क्रम। समाधान में इस तरह की प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप, दो प्रकार के पीसीआर उत्पादों को एक साथ संश्लेषित किया जा सकता है - सामान्य और उत्परिवर्ती। इसके अलावा, उपयोग किए गए प्राइमरों का डिज़ाइन उनके आणविक आकार द्वारा सामान्य और उत्परिवर्ती प्रवर्धन उत्पादों को स्पष्ट रूप से अलग करना संभव बनाता है। यह विधि बहुत स्पष्ट है और आपको म्यूटेंट एलील के होमो- और हेटेरोज़ीगस कैरिज दोनों को सत्यापित करने की अनुमति देती है।
प्रवर्धित डीएनए के साइट-निर्देशित संशोधन के लिए विधि
विधि तथाकथित बेमेल प्राइमर (टेम्पलेट के लिए पूरी तरह से पूरक नहीं) के पीसीआर में उपयोग पर आधारित है, जो एक न्यूक्लियोटाइड द्वारा टेम्पलेट डीएनए अनुक्रम से अलग है। उत्परिवर्ती पीसीआर उत्पाद की संरचना में निर्दिष्ट प्राइमर को शामिल करने के परिणामस्वरूप, इसमें प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस में से एक के लिए कृत्रिम रूप से निर्मित प्रतिबंध साइट बनाई गई है, जो प्रतिबंध विश्लेषण का उपयोग करके एक निश्चित ज्ञात उत्परिवर्तन के प्रत्यक्ष डीएनए निदान की अनुमति देता है। इस तरह के एक कृत्रिम प्रतिबंध साइट का निर्माण आवश्यक हो सकता है यदि खोज एक ज्ञात और सुलभ एंजाइम के अस्तित्व को प्रकट नहीं करती है, जिसका "प्राकृतिक" प्रतिबंध स्थल डीएनए अणु में अध्ययन किए गए उत्परिवर्तन की उपस्थिति के परिणामस्वरूप प्रभावित होता है। .
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर विधि (आर टी- पीसीआर)
इस पद्धति का उपयोग उन मामलों में किया जाता है जहां जीनोमिक डीएनए को अध्ययन की वस्तु के रूप में उपयोग करना अधिक सुविधाजनक होता है, लेकिन ऊतक के नमूनों के उचित प्रसंस्करण के बाद प्राप्त एक अधिक कॉम्पैक्ट और सूचना-समृद्ध सीडीएनए, जैसे कि बायोप्सी सामग्री या लिम्फोसाइटों की सेल लाइन, फाइब्रोब्लास्ट , आदि महत्वपूर्ण यहाँ स्थिति अध्ययन के तहत ऊतक में वांछित जीन की अभिव्यक्ति (कम से कम न्यूनतम) है।
पहले चरण में, एमआरएनए का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया जाता है, और परिणामी सीडीएनए अणु पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम करते हैं। इसके बाद, पर्याप्त मात्रा में प्रवर्धित महत्वपूर्ण सीडीएनए क्षेत्र अनुक्रमण और अन्य उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग विधियों, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रोफोरेटिक अध्ययन (विलोपन, सम्मिलन, आदि का पता लगाने) या एक प्रोटीन उत्पाद और इसके प्रत्यक्ष विश्लेषण को प्राप्त करने के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली में एकीकरण के अधीन है। .
यह विधि विशेष रूप से एक "छंटनी" प्रोटीन (बकवास म्यूटेशन, स्प्लिसिंग म्यूटेशन, बड़े विलोपन) के संश्लेषण के लिए अग्रणी म्यूटेशन का पता लगाने के लिए प्रभावी है - तथाकथित पीटीटी विश्लेषण (प्रोटीन ट्रंकेशन टेस्ट)। पीटीटी विश्लेषण का उपयोग आमतौर पर विस्तारित मल्टी-एक्सॉन जीन की जांच करते समय किया जाता है, जैसे कि ड्यूकेन / बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी, एटैक्सिया-टेलैंगिएक्टेसिया, या न्यूरोफाइब्रोमैटोसिस टाइप 1 के लिए जीन।
वास्तविक समय पीसीआर(वास्तविक समय पीसीआर)
हर साल, व्यावहारिक स्वास्थ्य सेवा में, रीयल-टाइम पीसीआर एक तेजी से लोकप्रिय निदान पद्धति बनती जा रही है। इसकी मौलिक विशेषता पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन उत्पादों के संचय की निगरानी और मात्रात्मक विश्लेषण और स्वचालित पंजीकरण और परिणामों की व्याख्या है। इस विधि में वैद्युतकणसंचलन चरण की आवश्यकता नहीं होती है, जो पीसीआर प्रयोगशाला के लिए आवश्यकताओं को कम कर देता है। उत्पादन स्थान में बचत, कर्मियों की संख्या में कमी और डीएनए/आरएनए परिमाणीकरण की मांग के लिए धन्यवाद, इस पद्धति का हाल के वर्षों में दुनिया के विकसित देशों में सबसे बड़े स्वच्छता महामारी, निदान और अनुसंधान केंद्रों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, पीसीआर को उसके वर्तमान ("क्लासिक") प्रारूप में बदलना।
वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन के दौरान डीएनए का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच का उपयोग करता है। रीयल-टाइम पीसीआर 20-60 मिनट के भीतर एक नमूने के पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है और सैद्धांतिक रूप से एक नमूने में एक भी डीएनए या आरएनए अणु का पता लगाने में सक्षम है।
चावल। 17. वास्तविक समय में पीसीआर।
रीयल-टाइम पीसीआर गुंजयमान प्रतिदीप्ति शमन का उपयोग करके प्रवर्धन के दौरान सीधे पीसीआर कैनेटीक्स को नियंत्रित करने के लिए टाकमैन प्रणाली का उपयोग करता है। पता लगाने के लिए, प्रवर्धित टुकड़े के मध्य भाग के लिए एक फ्लोरोफोर और एक शमन पूरक ले जाने वाली जांच का उपयोग किया जाता है। जब फ्लोरोफोर और क्वेंचर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच से बंधे होते हैं, तो केवल थोड़ी मात्रा में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन देखा जाता है। प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान, Taq पोलीमरेज़ की 5'-एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि के कारण, फ्लोरोसेंट लेबल समाधान में गुजरता है, शमन के आसपास से जारी किया जा रहा है, और एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न करता है जो संचय के अनुपात में वास्तविक समय में बढ़ता है प्रवर्धित (चित्र 17)।
जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ पीसीआर पर पीसीआर-रियल-टाइम के मुख्य लाभ:
पूरी विधि एक टेस्ट ट्यूब में होती है;
· विधि में 1 घंटा लगता है;
पर्याप्त 1-2 कार्य कक्ष;
परिणाम के गुणात्मक मूल्यांकन के साथ, इसकी मात्रा निर्धारित करना संभव हो जाता है (उदाहरण के लिए, एड्स या वायरल हेपेटाइटिस के लिए एंटीवायरल थेरेपी निर्धारित करते समय, वायरल लोड को जानना आवश्यक है, अर्थात प्रति यूनिट वायरस की मात्रा, जो वास्तविक प्रदान करती है -टाइम पीसीआर);
· नाटकीय रूप से संदूषण के जोखिम को कम करता है|
निष्कर्ष
पीसीआर विधि आण्विक जैविक अनुसंधान के सबसे आम तरीकों में से एक है। इस पद्धति का उपयोग चिकित्सकों द्वारा सार्थक रूप से किया जाना चाहिए, और एक डॉक्टर जो अपने काम में पीसीआर का उपयोग करने का निर्णय लेता है, उसे इस पद्धति की विशेषताओं और क्षमताओं के बारे में निश्चित ज्ञान होना चाहिए। दूसरे, चिकित्सक और पीसीआर प्रयोगशाला के बीच घनिष्ठ प्रतिक्रिया होनी चाहिए, जो जटिल मामलों के विश्लेषण और सही नैदानिक रणनीति के विकास के लिए आवश्यक है। तीसरा, पीसीआर विश्लेषण निदान (मुख्य रूप से संक्रामक रोगों) में रामबाण नहीं है और मौजूदा शोध विधियों को प्रतिस्थापित नहीं करता है, बल्कि केवल उनका पूरक है। और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि पीसीआर उस अंतर्ज्ञान और विश्लेषणात्मक सोच को प्रतिस्थापित नहीं कर सकता है जो सफलता की उम्मीद करने वाले डॉक्टर के पास होनी चाहिए।
पी . एस . आणविक-जैविक शोध - निदान और उपचार के संदर्भ बिंदुओं में परिवर्तन। आणविक जैविक विधियों का उपयोग प्रयोगशाला निदान में जोर में आमूल-चूल परिवर्तन की संभावना से जुड़ा है। हम न केवल समय पर सूचना के बारे में बात कर सकते हैं, बल्कि इसकी अग्रिम प्राप्ति के बारे में भी बात कर सकते हैं। यदि अब ज्यादातर मामलों में प्रयोगशाला अध्ययन पहले से ही एक उन्नत बीमारी और उपचार शुरू कर दिया गया है, तो आणविक जैविक प्रयोगशाला की जानकारी से किसी व्यक्ति के कुछ प्रकार के विकृति विज्ञान और कुछ दवाओं के प्रति संवेदनशीलता की डिग्री की पहचान करना संभव हो जाता है, जो भविष्य की दवा के भविष्य कहनेवाला, निवारक और व्यक्तिगत चरित्र की पुष्टि करने की अनुमति देगा।
निदान और उपचार फोकस का परिवर्तन
वंशानुगत रोग
आज भविष्य में
निदान आनुवंशिक पासपोर्ट
8. प्रतिदीप्ति पहचान (मात्रात्मक विश्लेषण, रीयल-टाइम पीसीआर) के साथ एक पीसीआर प्रयोगशाला के लिए कितने कार्य कक्षों की आवश्यकता होती है?
9. पहचान क्या है?
10. डीएनए डायग्नोस्टिक्स के कौन से तरीके प्रतिष्ठित हैं?
11. पीसीआर के आधार पर कौन सा एंजाइम काम करता है?
12. डिटेक्शन ज़ोन को अन्य कार्य क्षेत्रों से अलग करने की आवश्यकता क्यों है?
13. प्रतिबंध स्थल क्या है?
14. डीएनए डायग्नोस्टिक्स की प्रत्यक्ष विधि और अप्रत्यक्ष विधि के बीच क्या अंतर है?
15. अनुक्रमण क्या है?
16. मल्टीप्लेक्स पीसीआर क्या है?
17. पीसीआर द्वारा किस प्रकार के उत्परिवर्तन का निर्धारण किया जाता है?
18. संदूषण क्या है?
19. एलील-विशिष्ट प्रवर्धन विधि का सार क्या है?
20. पीसीआर सामग्री के लिए भंडारण की स्थिति?
21. प्रवर्धन के लिए किस उपकरण का प्रयोग किया जाता है?
22. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर (आरटी-पीसीआर) की विधि क्या है?
23. पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के लिए सामग्री क्या है?
24. संदूषण के प्रकारों की सूची बनाएं?
स्वाध्याय के लिए टेस्ट
1. प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस:
ए) एंजाइम जो डीएनए को सख्ती से विशिष्ट स्थानों में "तोड़" देते हैं;
बी) डीएनए अणु में सिलाई करने वाले एंजाइम टूट जाते हैं;
c) एंजाइम जो यौगिक प्रदान करते हैं जो डीएनए की मरम्मत करते हैं।
2. जीन प्रवर्धन:
3. एक ज्ञात अनुक्रम के उत्परिवर्तित जीन के कारण होने वाली बीमारियों के निदान के लिए आणविक आनुवंशिकी की कौन सी विधि का उपयोग किया जाता है?
ए) एक विशिष्ट प्रतिबंध का उपयोग;
बी) विशिष्ट आणविक जांच का उपयोग करके प्रत्यक्ष पता लगाना;
ग) सामान्य प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता के वितरण का पारिवारिक विश्लेषण।
4. डीएनए श्रृंखला बनाना:
क) डीएनए आधार अनुक्रम की पहचान;
बी) किसी भी डीएनए खंड की बार-बार पुनरावृत्ति;
ग) अध्ययन किए गए जीन वाले डीएनए के टुकड़े का अलगाव।
5. का उपयोग करके डीएनए नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं :
बी) कोरियोनिक विली;
ग) एमनियोटिक द्रव;
डी) एमनियोटिक द्रव कोशिकाएं;
ई) त्वचा, मांसपेशियों, यकृत की बायोप्सी,
ई) बिंदु "सी" को छोड़कर सब कुछ सही है,
जी) बिंदु "डी" को छोड़कर सब कुछ सही है,
ज) उपरोक्त सभी सही हैं।
6. पीसीआर द्वारा कौन से म्यूटेशन का निदान किया जाता है?
ए) जीनोमिक;
बी) गुणसूत्र;
ग) जीन (बिंदु)।
7. प्राइमर है:
क) डीएनए का एक पूरक खंड;
बी) एक म्यूटेंट या सामान्य जीन के पूरक के लिए एक सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लेबल (रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंटली) अनुक्रम;
c) एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड "बीज" के रूप में कार्य करता है और एक डीएनए या आरएनए टेम्पलेट पर एक पॉलीन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के संश्लेषण की शुरुआत करता है।
8. पीसीआर पद्धति का सिद्धांत किसने विकसित किया?
b) के. मुलिस
9. क्या ट्राइन्यूक्लियोटाइड रिपीट (गतिशील प्रकार के उत्परिवर्तन) के विस्तार का निदान करने के लिए पीसीआर विधि का उपयोग किया जाता है?
10. पीसीआर का उपयोग किन क्षेत्रों में किया जाता है?
ए) नैदानिक चिकित्सा;
बी) ट्रांसजेनिक जीवों की परिभाषा (जीएमओ)
ग) व्यक्ति की पहचान, पितृत्व की स्थापना, आपराधिकता
D। उपरोक्त सभी
घ) उपरोक्त में से कोई नहीं।
नमूना उत्तर: 1 - ए; 2 - बी; 3 - बी; 4 - ए; 5 - ई; 6 - में; 7 - में; 8 - बी; 9 - ए, 10 - डी।
मुख्य
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विधि के मुख्य सिद्धांत
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
सामान्य चिकित्सा (060101) और बाल रोग (060103) की विशिष्टताओं में 3-4 पाठ्यक्रमों के छात्रों के पाठ्येतर कार्य के लिए कार्यप्रणाली मैनुअल।
SEI HPE "स्वास्थ्य और सामाजिक विकास के लिए संघीय एजेंसी की क्रास्नोयार्स्क स्टेट मेडिकल अकादमी"
रूस, क्रास्नोयार्स्क,
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को 30 वर्षों से जाना जाता है। पुरातत्व से लेकर आनुवंशिकी तक कई क्षेत्रों में इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
यह पीसीआर विधि है जो पितृत्व स्थापित करने में मदद करती है, लेकिन इसका उपयोग अक्सर मानव शरीर में विभिन्न संक्रामक रोगों का पता लगाने के लिए किया जाता है।
पीसीआर विश्लेषण कैसे किया जाता है और यह क्या है? हम इन सवालों के जवाब विस्तार से देने की कोशिश करेंगे।
पीसीआर विश्लेषण - यह क्या है?
पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आणविक आनुवंशिक निदान का एक अत्यधिक सटीक तरीका है, जो मनुष्यों में तीव्र और पुरानी दोनों अवस्थाओं में विभिन्न संक्रामक और वंशानुगत रोगों का पता लगाना संभव बनाता है, और बीमारी के प्रकट होने से बहुत पहले।
पीसीआर विधि बिल्कुल विशिष्ट है और सही ढंग से किया गया गलत सकारात्मक परिणाम नहीं दे सकता है। यानी अगर कोई संक्रमण नहीं है, तो विश्लेषण कभी नहीं दिखाएगा कि यह है। इसलिए, अब बहुत बार, निदान की पुष्टि करने के लिए, रोगज़नक़ और इसकी प्रकृति को निर्धारित करने के लिए एक अतिरिक्त पीसीआर विश्लेषण लिया जाता है।
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 1983 में कैरी मुलिस (यूएसए) द्वारा विकसित किया गया था, जिसके लिए उन्हें 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था।
इस पद्धति का क्या फायदा है?
इस पद्धति से निदान आपको अध्ययन सामग्री में निहित जीन में सीधे रोगज़नक़ खोजने की अनुमति देता है। यह यौन संक्रमण, अव्यक्त संक्रमण, विभिन्न यौन संचारित रोगों के लिए सबसे सटीक विश्लेषण है।
पीसीआर डायग्नोस्टिक्स और अन्य तरीकों के बीच अंतर प्रयोगशाला अनुसंधान इस प्रकार हैं:
- विधि का उद्देश्य स्वयं रोगज़नक़ की पहचान करना है;
- पीसीआर द्वारा निदान बहुमुखी है: कई रोगजनकों का पता लगाने के लिए;
- रोग, रोगी का केवल एक जैविक नमूना ही पर्याप्त है;
- विधि अत्यधिक संवेदनशील है और अन्य क्रॉस-प्रतिक्रियाओं के साथ नहीं है।
इसके अलावा, पीसीआर डायग्नोस्टिक्स का लाभ यह है कि रोगी की कोई भी जैविक सामग्री विश्लेषण के लिए उपयुक्त है: रक्त, जननांग अंगों से स्राव, मूत्र, वीर्य।
पीसीआर स्मीयर द्वारा किन संक्रमणों का पता लगाया जा सकता है?
शरीर में बड़ी संख्या में संक्रामक एजेंट मौजूद हो सकते हैं, जिनमें "छिपे हुए" भी शामिल हैं जो लंबे समय तक खुद को प्रकट नहीं करते हैं।
पीसीआर स्मीयर विश्लेषण ऐसे संक्रमणों का पता लगाना संभव बनाता है:
- जननांग अंगों के यूरेप्लाज्मोसिस;
- कैंडिडिआसिस ();
- दाद;
- कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति;
- हार्मोनल स्थिति का आकलन करें;
पीसीआर के लिए अध्ययन की गई सामग्री आमतौर पर थूक, लार, मूत्र, रक्त है। विश्लेषण करने से पहले, डॉक्टर से प्रारंभिक परामर्श प्राप्त करने के बाद, इसके लिए सावधानीपूर्वक तैयारी करना आवश्यक है।
पीसीआर के लिए रक्त आमतौर पर खाली पेट दिया जाता है। जब अनुसंधान के लिए सामग्री सर्वाइकल कैनाल या मूत्रमार्ग से ली जाती है तो विश्लेषण से अच्छे परिणाम दिखाई देते हैं। इस मामले में, संभोग के एक दिन बाद पीसीआर डायग्नोस्टिक्स करना सबसे अच्छा है।
पीसीआर की किस्में
पीसीआर का उपयोग कई क्षेत्रों में विश्लेषण और वैज्ञानिक प्रयोगों में किया जाता है। विभिन्न विश्लेषण विधियां हैं:
- रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर(रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, आरटी-पीसीआर (अंग्रेजी)) - आरएनए लाइब्रेरी से ज्ञात अनुक्रम को बढ़ाने, अलग करने या पहचानने के लिए उपयोग किया जाता है।
- उलटा पीसीआर(उलटा पीसीआर (अंग्रेजी)) - यदि वांछित अनुक्रम के भीतर केवल एक छोटा क्षेत्र ज्ञात हो तो इसका उपयोग किया जाता है। यह विधि विशेष रूप से उपयोगी होती है जब डीएनए को जीनोम में डालने के बाद पड़ोसी अनुक्रमों को निर्धारित करना आवश्यक होता है।
- नेस्टेड पीसीआर का उपयोग प्रतिक्रिया के साइड उत्पादों की संख्या को कम करने के लिए किया जाता है। प्राइमरों के दो जोड़े का प्रयोग करें और लगातार दो प्रतिक्रियाएं करें।
- असममित पीसीआर(अंग्रेजी असममित पीसीआर) - तब किया जाता है जब मुख्य रूप से मूल डीएनए की श्रृंखलाओं में से एक को बढ़ाना आवश्यक होता है। कुछ अनुक्रमण और संकरण विश्लेषण तकनीकों में उपयोग किया जाता है।
- मात्रात्मक पीसीआर(मात्रात्मक पीसीआर, क्यू-पीसीआर (अंग्रेजी)) या रीयल-टाइम पीसीआर - प्रत्येक प्रतिक्रिया चक्र में किसी विशेष पीसीआर उत्पाद की मात्रा के माप को सीधे देखने के लिए उपयोग किया जाता है।
- चरणबद्ध पीसीआर (टचडाउन पीसीआर (अंग्रेजी)) - इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, प्राइमरों के गैर-विशिष्ट बंधन का प्रभाव कम हो जाता है।
- समूह-विशिष्ट पीसीआर(अंग्रेजी समूह-विशिष्ट पीसीआर) - इन अनुक्रमों के लिए रूढ़िवादी प्राइमरों का उपयोग करके एक या विभिन्न प्रजातियों के बीच संबंधित अनुक्रमों के लिए पीसीआर।
यदि टेम्पलेट का न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम आंशिक रूप से ज्ञात है या बिल्कुल भी ज्ञात नहीं है, तो पतित प्राइमरों का उपयोग किया जा सकता है, जिसके अनुक्रम में पतित स्थिति होती है जिसमें कोई आधार स्थित हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्राइमर अनुक्रम हो सकता है: ...ATH... जहां H, A, T, या C है।
किन जैविक सामग्रियों का अध्ययन किया जा रहा है?
विभिन्न जैविक मीडिया और मानव तरल पदार्थ पीसीआर अनुसंधान के लिए एक सामग्री के रूप में काम कर सकते हैं, जिसमें बैक्टीरिया के विदेशी डीएनए या वायरस के डीएनए या आरएनए का पता लगाया जा सकता है:
- मूत्र। इसका उपयोग पुरुषों में जननांग पथ और महिलाओं में मूत्र अंगों के संक्रामक घावों के लिए किया जा सकता है (पुरुषों में, सामग्री के रूप में मूत्र का उपयोग उपकला स्क्रैपिंग की जगह लेता है)।
- कफ। इसका उपयोग तपेदिक के निदान के लिए और कम बार क्लैमाइडिया और मायकोप्लास्मोसिस के श्वसन रूपों के निदान के लिए किया जाता है। 15-20 मिलीलीटर की मात्रा में थूक एक बाँझ (डिस्पोजेबल) शीशी में एकत्र किया जाता है।
- जैविक तरल पदार्थ. संकेत के अनुसार प्रोस्टेट रस, फुफ्फुस, मस्तिष्कमेरु द्रव, एमनियोटिक द्रव, आर्टिकुलर द्रव, ब्रोन्कोएल्वियोलर लैवेज, लार लिया जाता है।
- श्लेष्मा झिल्ली से उपकला स्क्रैपिंग. आमतौर पर यौन संचारित रोगों (एसटीडी) का निदान करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि गोनोरिया, क्लैमाइडिया, माइकोप्लाज्मोसिस, यूरियाप्लास्मोसिस, ट्राइकोमोनिएसिस, गार्डनरेलोसिस, हर्पेटिक और अन्य संक्रमण जो श्लेष्म झिल्ली को प्रभावित करते हैं।
- बायोप्सी। अक्सर, हेलिकोबैक्टर पाइलोरी संक्रमण का पता लगाने के लिए पेट और ग्रहणी के बायोप्सी नमूनों का उपयोग किया जाता है।
- रक्त, प्लाज्मा, सीरम. हेपेटाइटिस बी, सी, डी, जी वायरस, दाद, सीएमवी, एचआईवी, मानव जीन के पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
विश्लेषण की तैयारी कैसे करें?
पीसीआर परिणाम की विश्वसनीयता सीधे परीक्षा के लिए सामग्री की डिलीवरी की शुद्धता पर निर्भर करती है। सामग्री दूषित नहीं होनी चाहिए, अन्यथा अध्ययन का परिणाम वस्तुनिष्ठ नहीं होगा। पीसीआर टेस्ट लेने से पहले सबसे महत्वपूर्ण सिफारिशों में निम्नलिखित आवश्यकताएं शामिल हैं:
- मूत्र सुबह में एक बाँझ कंटेनर में दिया जाता है।
- संक्रमण के लिए रक्त परीक्षण सुबह खाली पेट लेना चाहिए।
- परीक्षण से एक दिन पहले आपको यौन सक्रिय नहीं होना चाहिए।
विचाराधीन प्रक्रिया के बाद विश्लेषण का परिणाम 1.5-2 दिनों में तैयार हो जाएगा। ऐसी स्थितियां हैं जब परिणाम उसी दिन तैयार किया जा सकता है।
पीआरपी के विश्लेषण का गूढ़ रहस्य
प्रस्तुत अध्ययन की व्याख्या करने की प्रक्रिया इसकी सरलता के लिए उल्लेखनीय है। सामग्री की डिलीवरी के 1.5-2 दिन बाद पीसीआर विश्लेषण के परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। कुछ मामलों में, परिणाम पहले दिन तैयार होता है, और इसका मतलब यह हो सकता है:
- नकारात्मक परिणामदिखाता है कि निदान की जा रही सामग्री में वांछित संक्रामक एजेंट नहीं है।
- पीसीआर पॉजिटिवइंगित करता है कि मानव शरीर में रोगज़नक़ का डीएनए या आरएनए मौजूद है।
कुछ मामलों में, सूक्ष्मजीवों का मात्रात्मक निर्धारण किया जाता है। अवसरवादी रोगजनकों के कारण होने वाली बीमारियों में यह विशेष रूप से सच है। चूंकि ये बैक्टीरिया अधिक मात्रा में होने पर ही अपना नकारात्मक प्रभाव दिखाते हैं।
इसके अलावा, मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण चिकित्सीय रणनीति के चुनाव और ऐसे के उपचार की निगरानी के उद्देश्य से महत्वपूर्ण है विषाणु संक्रमणजैसे एचआईवी और हेपेटाइटिस वायरस।
संक्रमण के निदान में पीसीआर कितना सही है?
पीसीआर पद्धति की विशेषता उच्च सटीकता, विशिष्टता और संवेदनशीलता है। इसका मतलब है कि यह विश्लेषण करने में सक्षम है:
- संक्रमण की उपस्थिति या अनुपस्थिति का सटीक निर्धारण;
- निर्दिष्ट करें कि यह किस प्रकार का संक्रमण है (विशिष्टता);
- जैविक सामग्री में माइक्रोबियल डीएनए की बहुत कम सामग्री पर भी संक्रमण का पता लगा सकते हैं,
- जिसका परीक्षण (संवेदनशीलता) किया गया हो।
पीसीआर विश्लेषण: मूल्य और शर्तें
किसी विशिष्ट विश्लेषण की कीमत इस बात पर निर्भर करेगी कि किस संक्रमण के लिए आपका परीक्षण किया जाएगा। अनुमानित मूल्य और शर्तें:
- एसटीआई: 300-500 रूबल, शर्तें - 1 दिन;
- एपस्टीन-बार वायरस, मानव पेपिलोमावायरस, दाद, साइटोमेगालोवायरस: 300-500 रूबल, शर्तें - 1 दिन;
- हेपेटाइटिस ए, बी, सी, डी, जी: गुणात्मक विश्लेषण 650 रूबल, मात्रात्मक विश्लेषण 2000 रूबल। शर्तें - 5 दिन तक;
- हेपेटाइटिस सी वायरस के एंटीबॉडी, कुल (एंटी-एचसीवी) - 420 रूबल;
- हेपेटाइटिस सी वायरस के एंटीबॉडी, आईजीएम (एंटी-एचसीवी आईजीएम) - 420 रूबल;
- हेलिकोबैक्टर पाइलोरी (हेलिकोबैक्टर पाइलोरी): 300-400 रूबल, शर्तें - 1 दिन;
- एचआईवी (एंटीबॉडी और एंटीजन) - 380 रूबल;
- एचआईवी आरएनए, गुणात्मक रूप से - 3,500 रूबल;
- एचआईवी आरएनए, मात्रात्मक - 11,000 रूबल।
पैसे बचाने के लिए, आप विश्लेषणों का एक निश्चित पैकेज चुन सकते हैं। यह सेवा अधिकांश क्लीनिकों द्वारा प्रदान की जाती है जहां आप पीआरसी पद्धति (इन विट्रो, ऑनक्लिनिक, आदि) का उपयोग करके विश्लेषण कर सकते हैं।
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर, पीसीआर - पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) जैविक नमूने में कुछ डीएनए अंशों (जीन) की कई प्रतियाँ प्राप्त करने की एक विधि है।
आणविक जीव विज्ञान की एक विधि के रूप में पीसीआर का सार शर्तों के तहत विशेष एंजाइमों का उपयोग करके एक निश्चित जीन (डीएनए के खंड) की बार-बार चयनात्मक प्रतिलिपि बनाना है। कृत्रिम परिवेशीय. पीसीआर की एक महत्वपूर्ण विशेषता एक विशिष्ट डीएनए क्षेत्र (जीन) की प्रतियां प्राप्त करना है जो निर्दिष्ट शर्तों को पूरा करती है। डीएनए नकल प्रक्रिया का एक पर्याय "प्रवर्धन" है। डी एन ए की नकल विवो मेंप्रवर्धन भी माना जा सकता है। हालांकि, प्रतिकृति के विपरीत, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन डीएनए के छोटे हिस्सों (अधिकतम 40,000 बेस जोड़े) को बढ़ाता है।
बुनियादी सिद्धांत
तो, पीसीआर दोहराए गए तापमान चक्रों की प्रक्रिया में इन विट्रो में कुछ डीएनए अंशों की बार-बार नकल है। प्रतिक्रिया एक तापमान चक्र के भीतर कैसे आगे बढ़ती है?
एक न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला का निर्माण एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा किया जाता है। हालाँकि, आरंभ करने के लिए एंजाइम को लॉन्च पैड की आवश्यकता होती है। साइटें "प्राइमर्स" (बीज) हैं - सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स 15-20 न्यूक्लियोटाइड्स लंबे। दो प्राइमर (आगे और पीछे) होने चाहिए, वे डीएनए टेम्पलेट के अनुभागों के पूरक हैं, और यह प्राइमरों द्वारा सीमित डीएनए टुकड़ा है जिसे बार-बार डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा कॉपी किया जाएगा। पोलीमरेज़ का काम क्रमिक रूप से न्यूक्लियोटाइड्स को जोड़ना है जो टेम्पलेट डीएनए अनुक्रम के पूरक हैं। इस प्रकार, एक तापमान चक्र में, दो नए डीएनए टुकड़े फिर से संश्लेषित होते हैं (चूंकि डीएनए अणु डबल-फंसे हुए हैं, शुरू में दो टेम्पलेट हैं)। इस प्रकार, 25-35 चक्रों में, प्राइमर द्वारा निर्धारित डीएनए क्षेत्र की अरबों प्रतियां परखनली में जमा हो जाती हैं। एकल चक्र की संरचना को निम्नानुसार दर्शाया जा सकता है:
- डीएनए विकृतीकरण (पिघलना, डीएनए श्रृंखला पृथक्करण) - 95°C - 1 या 2 मिनट;
- प्राइमर एनीलिंग (बीज डीएनए टेम्प्लेट से बंधते हैं, इस चरण का तापमान प्राइमर की न्यूक्लियोटाइड संरचना द्वारा निर्धारित किया जाता है) - 60 डिग्री सेल्सियस (उदाहरण के लिए) - 1 मिनट;
- डीएनए का बढ़ाव (पोलीमरेज़ एक डीएनए श्रृंखला को संश्लेषित करता है) - 72 ° C - 1 मिनट (समय संश्लेषित टुकड़े की लंबाई पर निर्भर करता है)।
प्रयोगशाला में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि के आवेदन के लिए सहायक आधार में शामिल होना चाहिए:
- (या, जैसा कि इसे थर्मल साइक्लर भी कहा जाता है);
- एस के लिए सिस्टम (पीसीआर परिणामों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए);
- सिस्टम (पीसीआर परिणामों के विश्लेषण के लिए);
- (नमूना तैयार करने के लिए);
- सेट (यांत्रिक या इलेक्ट्रॉनिक)।
पीसीआर प्रयोगशाला के पूर्ण कामकाज के लिए मुख्य और सहायक उपकरण के अलावा, कुछ उपभोग्य सामग्रियों की आवश्यकता होती है: बाँझ युक्तियाँ, टेस्ट ट्यूब, टेस्ट ट्यूब और डिस्पेंसर के लिए रैक।
एक पूर्ण पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के संचालन के लिए एक पारंपरिक पीसीआर प्रयोगशाला में अभिकर्मक आधार में एक डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम एक बफर, प्राइमर (डीएनए टेम्पलेट के विश्लेषण किए गए खंड की शुरुआत और अंत के पूरक छोटे सिंथेटिक डीएनए टुकड़े), एक मिश्रण शामिल है। न्यूक्लियोटाइड्स (ए, टी, डी, सी)। शुद्ध पानी भी नितांत आवश्यक है।
पीसीआर विधि के लाभ
अध्ययन की उच्च संवेदनशीलता
विधि की संवेदनशीलता ऐसी है कि 10 5 कोशिकाओं के नमूने में एक बार होने पर भी पीसीआर में बढ़ाना और लक्ष्य अनुक्रम की पहचान करना संभव है।
विश्लेषण विशिष्टता
पीसीआर अन्य सूक्ष्मजीवों और मेजबान जीव के डीएनए के साथ-साथ जीनोटाइपिंग से डीएनए की उपस्थिति में एक विशिष्ट संक्रामक एजेंट के डीएनए का पता लगाने की अनुमति देता है। विशेष रूप से प्रतिक्रिया घटकों (प्राइमर्स) का चयन करके, आप एक साथ निकट संबंधी सूक्ष्मजीवों के डीएनए का पता लगा सकते हैं।
पीसीआर विधि की सार्वभौमिकता
तथ्य यह है कि संक्रामक रोगों या मानव वंशानुगत रोगों के पीसीआर निदान के लिए, आप एक ही उपकरण का उपयोग कर सकते हैं, नमूने (नमूने) तैयार करने और विश्लेषण स्थापित करने के लिए सार्वभौमिक प्रक्रियाओं का पालन कर सकते हैं, साथ ही साथ एक ही प्रकार की अभिकर्मक किट भी।
समय बचाने वाला
पीसीआर का एक महत्वपूर्ण लाभ सांस्कृतिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी कार्य के चरणों की अनुपस्थिति है। नमूनों की तैयारी, परिणामों की प्रतिक्रिया और विश्लेषण को अधिकतम रूप से सुगम और बड़े पैमाने पर स्वचालित किया जाता है। इसके कारण रिजल्ट प्राप्त करने के समय को घटाकर 4-5 घंटे किया जा सकता है।
पीसीआर विधि की प्रभावशीलता
अध्ययन की गई नैदानिक सामग्री की चौड़ाई
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन में एक नमूने के रूप में, न केवल रोगी से जैविक सामग्री का उपयोग किया जा सकता है, बल्कि कई अन्य सबस्ट्रेट्स भी हैं जिनमें डीएनए अणुओं को उच्च संवेदनशीलता के साथ पहचाना जा सकता है, उदाहरण के लिए, पानी, मिट्टी, भोजन, सूक्ष्मजीव, धोने और बहुत अधिक।
ऊपर सूचीबद्ध इस अनूठी पद्धति के सभी लाभ - उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता, एक संक्रामक एजेंट की पहचान और किसी भी मानव जीन की जीनोटाइपिंग, उच्च दक्षता और समय की बचत, उपकरण आधार की सार्वभौमिकता - पीसीआर पद्धति को आज नैदानिक रूप में व्यापक रूप से उपयोग करने की अनुमति देते हैं। निदान, मेडिकल अभ्यास करना, वैज्ञानिक अनुसंधान, गुणवत्ता नियंत्रण और कई अन्य क्षेत्रों।
पीसीआर का आवेदन
आणविक जीव विज्ञान की आधुनिक पद्धति के रूप में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के अनुप्रयोग के क्षेत्र विविध हैं। यह काफी हद तक उस सामग्री की चौड़ाई के कारण है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है (लगभग हर चीज जिससे कम या ज्यादा उच्च-गुणवत्ता वाले डीएनए को अलग किया जा सकता है), साथ ही साथ चयनित प्राइमर भी। पीसीआर के आवेदन के मुख्य क्षेत्र:
नैदानिक दवा
- संक्रामक रोगों का निदान
- वंशानुगत रोगों का निदान
- उत्परिवर्तन का पता लगाना
- जीनोटाइपिंग
- सेलुलर प्रौद्योगिकियां
- आनुवंशिक पासपोर्ट का निर्माण
परिस्थितिकी
- पर्यावरणीय निगरानी
- खाद्य विश्लेषण
- आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (जीएमओ) का विश्लेषण
फोरेंसिक दवा और अपराध विज्ञान
- व्यक्तिगत पहचान
- पितृत्व
औषध
पशु चिकित्सा
वैज्ञानिक अनुसंधान (आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी)
पीसीआर प्रयोगशाला का संगठन
आदेश की जानकारी
| नाम | मात्रा | उत्पादन | तरीका | बिल्ली।नंबर |
|---|---|---|---|---|
1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)
2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि का सिद्धांत
2.1 प्रतिक्रिया मिश्रण में कई घटकों की उपस्थिति
2.2 तापमान साइकिल चलाना
2.3 प्राइमर चयन के मूल सिद्धांत
2.4 पठार प्रभाव
3. पीसीआर सेटिंग के चरण
3.2 प्रवर्धन
3.4.1 सकारात्मक नियंत्रण
3.4.2 आंतरिक नियंत्रण
4.1 गुणात्मक विश्लेषण
4.1.2 आरएनए अणुओं का पता लगाना
3.1 जैविक सामग्री का नमूना तैयार करना
कार्यों के आधार पर, डीएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है। उनका सार एक जैविक उत्पाद से डीएनए के निष्कर्षण (निष्कर्षण) और पीसीआर के लिए उपयुक्त शुद्धता के साथ डीएनए की तैयारी प्राप्त करने के लिए विदेशी अशुद्धियों को हटाने या बेअसर करने में निहित है।
मर्मर द्वारा वर्णित शुद्ध डीएनए तैयारी प्राप्त करने की विधि को मानक माना जाता है और यह पहले से ही शास्त्रीय बन चुकी है। इसमें एंजाइमैटिक प्रोटियोलिसिस शामिल है, जिसके बाद अल्कोहल के साथ डिप्रोटिनाइजेशन और डीएनए पुनर्वसन होता है। यह विधि शुद्ध डीएनए तैयारी प्राप्त करना संभव बनाती है। हालांकि, यह काफी श्रमसाध्य है और इसमें फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे आक्रामक और तीखे पदार्थों के साथ काम करना शामिल है।
वर्तमान में लोकप्रिय तरीकों में से एक बूम एट अल द्वारा प्रस्तावित डीएनए निष्कर्षण विधि है। यह विधि कोशिका विश्लेषण के लिए एक मजबूत चाओट्रोपिक एजेंट, गुआनिडाइन थायोसाइनेट (GuSCN) के उपयोग पर आधारित है, और बाद में एक वाहक (ग्लास बीड्स, डायटोमेसियस अर्थ, ग्लास मिल्क, आदि) पर डीएनए के अवशोषण पर आधारित है। धुलाई के बाद, वाहक पर सोखे गए नमूने में डीएनए रहता है, जिसमें से इसे रेफरेंस बफर का उपयोग करके आसानी से हटाया जा सकता है। प्रवर्धन के लिए नमूना तैयार करने के लिए विधि सुविधाजनक, तकनीकी रूप से उन्नत और उपयुक्त है। हालांकि, वाहक पर अपरिवर्तनीय सोर्प्शन के साथ-साथ कई धुलाई के दौरान डीएनए हानि संभव है। नमूने में डीएनए की थोड़ी मात्रा के साथ काम करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, GuSCN की ट्रेस मात्रा भी PCR को बाधित कर सकती है। इसलिए, इस पद्धति का उपयोग करते समय, शर्बत का सही विकल्प और तकनीकी बारीकियों का सावधानीपूर्वक पालन बहुत महत्वपूर्ण है।
नमूना तैयार करने के तरीकों का एक अन्य समूह चिलीक्स-प्रकार के आयन एक्सचेंजर्स के उपयोग पर आधारित है, जो कांच के विपरीत, डीएनए को अधिशोषित नहीं करते हैं, लेकिन इसके विपरीत, प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करने वाली अशुद्धियां। एक नियम के रूप में, इस तकनीक में दो चरण शामिल हैं: नमूना उबलना और आयन एक्सचेंजर पर अशुद्धियों का सोखना। निष्पादन की सरलता के कारण यह विधि अत्यंत आकर्षक है। ज्यादातर मामलों में, यह नैदानिक सामग्री के साथ काम करने के लिए उपयुक्त है। दुर्भाग्य से, कभी-कभी अशुद्धियों वाले नमूने होते हैं जिन्हें आयन एक्सचेंजर्स का उपयोग करके हटाया नहीं जा सकता है। इसके अलावा, कुछ सूक्ष्मजीवों को साधारण उबालने से नष्ट नहीं किया जा सकता है। इन मामलों में, नमूना प्रसंस्करण के अतिरिक्त चरणों को पेश करना आवश्यक है।
इस प्रकार, नमूना तैयार करने की विधि का चुनाव इच्छित विश्लेषण के उद्देश्यों की समझ के साथ किया जाना चाहिए।
3.2 प्रवर्धन
प्रवर्धन प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना और उसमें विश्लेषण किए गए डीएनए नमूने को जोड़ना आवश्यक है। इस मामले में, प्राइमर एनीलिंग की कुछ विशेषताओं को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। तथ्य यह है कि, एक नियम के रूप में, विश्लेषण किए गए जैविक नमूने में विभिन्न डीएनए अणु होते हैं, जिनके लिए प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर आंशिक होते हैं, और कुछ मामलों में, समरूपता महत्वपूर्ण होती है। इसके अलावा, प्राइमर-डिमर बनाने के लिए प्राइमर एक-दूसरे से एनील कर सकते हैं। दोनों पक्ष (गैर-विशिष्ट) प्रतिक्रिया उत्पादों के संश्लेषण के लिए प्राइमरों की एक महत्वपूर्ण खपत की ओर ले जाते हैं और परिणामस्वरूप, सिस्टम की संवेदनशीलता को काफी कम कर देते हैं। इससे वैद्युतकणसंचलन के दौरान प्रतिक्रिया के परिणामों को पढ़ना मुश्किल या असंभव हो जाता है।
3.3 प्रतिक्रिया परिणामों का मूल्यांकन
पीसीआर परिणामों का सही मूल्यांकन करने के लिए यह समझना महत्वपूर्ण है यह विधिमात्रात्मक नहीं है। सैद्धांतिक रूप से, एकल लक्ष्य डीएनए अणुओं के प्रवर्धन उत्पादों को पहले से ही 30-35 चक्रों के बाद वैद्युतकणसंचलन द्वारा पता लगाया जा सकता है। हालांकि, व्यवहार में यह केवल उन मामलों में किया जाता है जहां प्रतिक्रिया आदर्श के करीब की स्थितियों में होती है, जो अक्सर जीवन में नहीं होती है। डीएनए तैयारी की शुद्धता की डिग्री का प्रवर्धन की दक्षता पर विशेष रूप से बहुत प्रभाव पड़ता है; प्रतिक्रिया मिश्रण में कुछ अवरोधकों की उपस्थिति, जिनसे छुटकारा पाना कुछ मामलों में बेहद मुश्किल हो सकता है। कभी-कभी, उनकी उपस्थिति के कारण, लक्षित डीएनए अणुओं के दसियों हज़ारों को भी बढ़ाना संभव नहीं होता है। इस प्रकार, लक्ष्य डीएनए की प्रारंभिक मात्रा और प्रवर्धन उत्पादों की अंतिम मात्रा के बीच अक्सर कोई सीधा संबंध नहीं होता है।
3.3.1 क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन विधि
प्रवर्धन के परिणामों की कल्पना करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है। आकार द्वारा डीएनए अणुओं को अलग करने के आधार पर आज सबसे आम वैद्युतकणसंचलन की विधि है। ऐसा करने के लिए, agarose जेल की एक प्लेट तैयार की जाती है, जो एक विशेष डीएनए डाई, उदाहरण के लिए, एथिडियम ब्रोमाइड के अतिरिक्त 1.5-2.5% की सांद्रता पर एक इलेक्ट्रोफोरेटिक बफर में पिघलने के बाद जमी हुई agarose होती है। जमे हुए agarose एक स्थानिक जाली बनाता है। कंघी की मदद से डालने पर, जेल में विशेष कुएं बनते हैं, जिसमें प्रवर्धन उत्पाद बाद में जोड़े जाते हैं। जेल प्लेट को एक क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र में रखा गया है और एक निरंतर वोल्टेज स्रोत जुड़ा हुआ है। नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया डीएनए जेल में माइनस से प्लस तक जाना शुरू कर देता है। इसी समय, छोटे डीएनए अणु लंबे लोगों की तुलना में तेज़ी से आगे बढ़ते हैं। जेल में डीएनए आंदोलन की गति agarose, विद्युत क्षेत्र की ताकत, तापमान, वैद्युतकणसंचलन बफर की संरचना, और, कुछ हद तक, डीएनए की जीसी संरचना की एकाग्रता से प्रभावित होती है। समान आकार के सभी अणु समान गति से चलते हैं। डाई प्लेनर समूहों में डीएनए अणुओं में एम्बेडेड (इंटरकेलेट्स) है। वैद्युतकणसंचलन की समाप्ति के बाद, जो 10 मिनट से 1 घंटे तक रहता है, जेल को पराबैंगनी रेंज (254 - 310 एनएम) में प्रकाश उत्सर्जित करने वाले ट्रांसिल्यूमिनेटर के फिल्टर पर रखा जाता है। 260 एनएम पर डीएनए द्वारा अवशोषित यूवी ऊर्जा को डाई में स्थानांतरित किया जाता है, जिससे यह दृश्यमान स्पेक्ट्रम (590 एनएम) के नारंगी-लाल क्षेत्र में प्रतिदीप्त हो जाता है।
प्रवर्धन उत्पादों के बैंड की चमक भिन्न हो सकती है। हालाँकि, यह नमूने में लक्षित डीएनए की प्रारंभिक मात्रा से संबंधित नहीं हो सकता है।
3.3.2 कार्यक्षेत्र वैद्युतकणसंचलन विधि
ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन की विधि मौलिक रूप से क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन के समान है। उनका अंतर इस तथ्य में निहित है कि इस मामले में agarose के बजाय polyacrylamide जैल का उपयोग किया जाता है। यह ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन के लिए एक विशेष कक्ष में किया जाता है। Polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन agarose वैद्युतकणसंचलन की तुलना में एक उच्च संकल्प है और एक न्यूक्लियोटाइड की सटीकता के साथ विभिन्न आकारों के डीएनए अणुओं को भेद करना संभव बनाता है। Polyacrylamide जेल की तैयारी agarose की तुलना में कुछ अधिक जटिल है। इसके अलावा, एक्रिलामाइड है जहरीला पदार्थ. चूंकि 1 न्यूक्लियोटाइड की सटीकता के साथ प्रवर्धन उत्पाद के आकार को निर्धारित करने की आवश्यकता शायद ही कभी उत्पन्न होती है, नियमित कार्य में क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन विधि का उपयोग किया जाता है।
3.4 प्रवर्धन प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करना
3.4.1 सकारात्मक नियंत्रण
एक "सकारात्मक नियंत्रण" के रूप में वांछित सूक्ष्मजीव की डीएनए तैयारी का उपयोग करें। नियंत्रण डीएनए तैयारी के साथ प्रवर्धन द्वारा उत्पन्न एम्पलीकॉन्स से गैर-विशिष्ट आयाम आकार में भिन्न होते हैं। गैर-विशिष्ट उत्पादों का आकार सकारात्मक नियंत्रण से बड़ा या छोटा हो सकता है। सबसे खराब स्थिति में, ये आयाम मेल खा सकते हैं और वैद्युतकणसंचलन में सकारात्मक के रूप में पढ़े जाते हैं।
परिणामी प्रवर्धन उत्पाद की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए, एंजाइम लेबल या रेडियोधर्मी समस्थानिकों के साथ लेबल किए गए संकरण जांच (प्रवर्धित अनुक्रम के भीतर स्थित डीएनए क्षेत्र) और प्राइमरों के समान सिद्धांतों के अनुसार डीएनए के साथ बातचीत की जा सकती है। यह विश्लेषण को बहुत जटिल और लंबा करता है, और इसकी लागत काफी बढ़ जाती है।
3.4.2 आंतरिक नियंत्रण
प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ प्रत्येक ट्यूब में प्रवर्धन की प्रगति को नियंत्रित करना आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, एक अतिरिक्त, तथाकथित "आंतरिक नियंत्रण" का उपयोग किया जाता है। यह डीएनए की कोई भी तैयारी है जो वांछित सूक्ष्मजीव के डीएनए के समान नहीं है। यदि प्रतिक्रिया मिश्रण में आंतरिक नियंत्रण जोड़ा जाता है, तो यह वांछित संक्रामक एजेंट के क्रोमोसोमल डीएनए के रूप में प्राइमर एनीलिंग के लिए एक ही लक्ष्य बन जाएगा। आंतरिक नियंत्रण प्रवर्धन उत्पाद का आकार इसलिए चुना जाता है ताकि यह सूक्ष्मजीव के लक्ष्य डीएनए के प्रवर्धन से उत्पन्न एम्पलीकॉन्स से 2 या अधिक गुना बड़ा हो। नतीजतन, अगर आंतरिक नियंत्रण डीएनए को परीक्षण नमूने के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण में पेश किया जाता है, तो जैविक नमूने में एक सूक्ष्मजीव की उपस्थिति के बावजूद, आंतरिक नियंत्रण विशिष्ट एम्पलीकॉन्स के गठन का कारण होगा, लेकिन बहुत लंबा (भारी) सूक्ष्मजीव के एम्प्लिकॉन की तुलना में। प्रतिक्रिया मिश्रण में भारी एम्पलीकॉन्स की उपस्थिति प्रवर्धन प्रतिक्रिया के सामान्य पाठ्यक्रम और अवरोधकों की अनुपस्थिति का संकेत देगी। यदि आवश्यक आकार के एम्पलीकॉन नहीं बने थे, लेकिन आंतरिक नियंत्रण एम्पलीकॉन भी नहीं बने थे, तो यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि विश्लेषण किए गए नमूने में अवांछनीय अशुद्धियाँ हैं जिन्हें समाप्त किया जाना चाहिए, लेकिन वांछित डीएनए की अनुपस्थिति नहीं।
दुर्भाग्य से, इस दृष्टिकोण के सभी आकर्षण के बावजूद, इसमें एक महत्वपूर्ण दोष है। यदि प्रतिक्रिया मिश्रण में आवश्यक डीएनए मौजूद है, तो प्राइमरों के आंतरिक नियंत्रण के साथ प्रतिस्पर्धा के कारण इसके प्रवर्धन की दक्षता में तेजी से कमी आती है। यह परीक्षण नमूने में डीएनए की कम सांद्रता पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिससे गलत नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।
फिर भी, बशर्ते कि प्राइमरों के लिए प्रतिस्पर्धा की समस्या हल हो जाए, प्रवर्धन की दक्षता को नियंत्रित करने का यह तरीका निश्चित रूप से बहुत उपयोगी होगा।
4. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन पर आधारित तरीके
4.1 गुणात्मक विश्लेषण
पीसीआर की स्थापना की शास्त्रीय विधि, जिसके सिद्धांतों को ऊपर उल्लिखित किया गया था, को पीसीआर की सीमाओं पर काबू पाने और प्रतिक्रिया की दक्षता बढ़ाने के उद्देश्य से कुछ संशोधनों में विकसित किया गया है।
4.1.1 "हॉट स्टार्ट" का उपयोग करके पीसीआर कैसे सेट करें
प्रवर्धन प्रतिक्रिया के गैर-विशिष्ट उत्पादों के गठन के जोखिम को कम करने के लिए, "हॉट-स्टार्ट" नामक एक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। इसका सार प्रतिक्रिया शुरू करने की संभावना को रोकने के लिए है जब तक कि ट्यूब में स्थितियां नहीं पहुंच जाती हैं जो विशिष्ट एनीलिंग सुनिश्चित करती हैं। प्राइमर।
तथ्य यह है कि, एचसी संरचना और आकार के आधार पर, प्राइमरों में एक निश्चित पिघलने का तापमान (टीएम) होता है। यदि सिस्टम का तापमान टीएम से अधिक है, तो प्राइमर डीएनए स्ट्रैंड और विकृतीकरण का पालन करने में असमर्थ है। इष्टतम परिस्थितियों में, अर्थात्। पिघलने के तापमान के करीब एनीलिंग तापमान, प्राइमर एक डबल-स्ट्रैंडेड अणु बनाता है, अगर यह पूरी तरह से पूरक है और इस प्रकार प्रतिक्रिया की विशिष्टता सुनिश्चित करता है।
"हॉट स्टार्ट" को लागू करने के लिए कई विकल्प हैं:
विकृतीकरण तापमान पर ट्यूब को गर्म करने के बाद पहले चक्र के दौरान प्रतिक्रिया मिश्रण में टैक पोलीमरेज़ का परिचय।
एक पैराफिन परत द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण के अवयवों को परतों में अलग करना (निचले हिस्से में प्राइमर, टाक पोलीमरेज़ और ऊपरी हिस्से में लक्ष्य डीएनए), जो पैराफिन के पिघलने पर मिश्रित होते हैं (~ 65-75 0 С)।
Taq पोलीमरेज़ के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से बंधा एंजाइम पहले विकृतीकरण चरण के बाद ही सक्रिय हो जाता है, जब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अपरिवर्तनीय रूप से इनकार करते हैं और टाक पोलीमरेज़ की सक्रिय साइटों को छोड़ देते हैं।
इन सभी मामलों में, भले ही थर्मल साइकिलिंग की शुरुआत से पहले गैर-विशिष्ट एनीलिंग हुई हो, बढ़ाव नहीं होता है, और प्राइमर-डीएनए परिसरों को गर्म करने पर विकृत किया जाता है, इसलिए कोई भी गैर-विशिष्ट उत्पाद नहीं बनता है। इसके बाद, ट्यूब में तापमान गलनांक से नीचे नहीं गिरता है, जो एक विशिष्ट प्रवर्धन उत्पाद के गठन को सुनिश्चित करता है।
4.1.2 आरएनए अणुओं का पता लगाना
पीसीआर के लिए एक लक्ष्य के रूप में आरएनए का उपयोग करने की संभावना इस पद्धति के अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार करती है। उदाहरण के लिए, कई वायरस (हेपेटाइटिस सी, इन्फ्लूएंजा वायरस, पिकोर्नावायरस, आदि) के जीनोम आरएनए द्वारा दर्शाए जाते हैं। इसी समय, उनके जीवन चक्र में डीएनए में परिवर्तन का कोई मध्यवर्ती चरण नहीं होता है। आरएनए का पता लगाने के लिए, इसे पहले डीएनए के रूप में परिवर्तित किया जाना चाहिए। इसके लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाता है, जो दो अलग-अलग वायरसों से अलग होता है: एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस और मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस। इन एंजाइमों का उपयोग कुछ कठिनाइयों से जुड़ा है। सबसे पहले, वे थर्मोलेबल हैं और इसलिए 42 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं के तापमान पर उपयोग किया जा सकता है। चूंकि इस तापमान पर आरएनए अणु आसानी से माध्यमिक संरचनाएं बनाते हैं, प्रतिक्रिया दक्षता स्पष्ट रूप से कम हो जाती है और विभिन्न अनुमानों के अनुसार, लगभग 5% है। थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव थर्मस थर्मोफिलस से प्राप्त थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ का उपयोग करके इस खामी को दूर करने का प्रयास किया जा रहा है, जो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के रूप में एमएन 2+ की उपस्थिति में ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि प्रदर्शित करता है। यह एकमात्र ज्ञात एंजाइम है जो पोलीमरेज़ और ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि दोनों को प्रदर्शित करने में सक्षम है।
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन को अंजाम देने के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण, साथ ही पीसीआर में, बीज के रूप में प्राइमर और भवन निर्माण सामग्री के रूप में 4 dNTPs का मिश्रण होना चाहिए।
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन के बाद, परिणामी सीडीएनए अणु पीसीआर के लिए एक लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं।
5. पीसीआर स्थापित करने की तकनीकी प्रक्रिया का संगठन
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन की संभावित उच्च संवेदनशीलता पीसीआर प्रयोगशाला के विशेष रूप से सावधान डिजाइन के लिए बिल्कुल आवश्यक बनाती है। यह विधि की सबसे तीव्र समस्या - संदूषण के कारण है।
संदूषण - बाहरी वातावरण से विशिष्ट डीएनए अणुओं के प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रवेश करना जो प्रवर्धन प्रतिक्रिया में लक्ष्य के रूप में काम कर सकता है और गलत सकारात्मक परिणाम दे सकता है।
इस अप्रिय घटना से निपटने के कई तरीके हैं। उनमें से एक एंजाइम एन-यूरैसिल ग्लाइकोसिलेज़ (यूजी) का उपयोग है। यह विधि एम्बेडेड यूरैसिल के साथ डीएनए अणुओं को तोड़ने के लिए यूजी की क्षमता पर आधारित है। प्रवर्धन प्रतिक्रिया एक dNTP मिश्रण का उपयोग करके की जाती है जिसमें dTTP को यूरैसिल द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, और थर्मल साइकलिंग के बाद, ट्यूब में बनने वाले सभी एम्पलीकॉन्स में यूरैसिल होगा। यदि प्रवर्धन से पहले प्रतिक्रिया मिश्रण में एचसी जोड़ा जाता है, तो प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रवेश करने वाले एम्पलीकॉन्स नष्ट हो जाएंगे, जबकि मूल डीएनए बरकरार रहेगा और बाद में प्रवर्धन के लिए लक्ष्य के रूप में काम करेगा।
इस प्रकार, यह विधि केवल कुछ हद तक संदूषण के स्रोत को समाप्त करती है और झूठे सकारात्मक परिणामों की गारंटी नहीं देती है।
संदूषण के परिणामों से निपटने का एक अन्य तरीका प्रतिक्रिया चक्रों (25-30 चक्रों तक) की संख्या में महत्वपूर्ण कमी है। लेकिन इस दृष्टिकोण के साथ भी, झूठे सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने का जोखिम अधिक है, क्योंकि इस मामले में, अवरोधकों की अनुपस्थिति में, संदूषण के कारण प्रवर्धन उत्पाद प्राप्त करना आसान है।
इस प्रकार, झूठे सकारात्मक परिणामों का कारण बनने वाले डीएनए अणुओं को निष्क्रिय करने के उद्देश्य से पूर्व-प्रवर्धन उपायों के लाभों के बावजूद, सबसे कट्टरपंथी उपाय प्रयोगशाला का एक सुविचारित संगठन है।
निष्कर्ष
पीसीआर विधि वर्तमान में विभिन्न संक्रामक रोगों के निदान के लिए एक विधि के रूप में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाती है। पीसीआर आपको संक्रमण के एटियलजि की पहचान करने की अनुमति देता है, भले ही विश्लेषण के लिए लिए गए नमूने में रोगज़नक़ के केवल कुछ डीएनए अणु हों। एचआईवी संक्रमण, वायरल हेपेटाइटिस आदि के शुरुआती निदान में पीसीआर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। आज तक, लगभग कोई संक्रामक एजेंट नहीं है जिसे पीसीआर का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है।